다시 뛰는 공정도시 서울!

문서번호 종보전연구실-5713 결재일자 2018.12.4. 공개여부 대시민공개 방침번호 시 민 주무관 종보전연구실장 동물원장 유미현 여용구 12/04 어경연 협 조 조경과장 강인호 주무관 김효준 주무관 정소영 자생 식충식물 종동정을 위한 DNA 바코드 연구 결과보고 2018. 12. 서 울 대 공 원 (종보전연구실) 자생 식충식물 종동정을 위한 DNA 바코드 연구 결과보고 식물의 체계적의 종 관리와 식물 유전자원 보존을 위해 자생 식충식물 2종의 종동정 유전자분석을 실시하고, 그 결과를 아래와 같이 보고함 Ⅰ 추 진 근 거 c 자생식물 종 동정을 위한 유전자분석 요청(조경과-6058, 2018.11.01.) Ⅱ 추 진 내 용 c 분석대상 : 끈끈이 주걱과 식물 2종 그림 1. 식충식물 2종 분석방법 Primer name Sequence rbcL-F ATGTCACCACAAACAGAAAC rbcL-R TCGCATGTACCTGCAGTAGC PCR을 위한 Primer 준비 PCR을 위한 전처리 및 DNA추출 과정 - E-tube에 EB buffer를 70ul정도 분주한다 - 식물체가 버퍼에 잠기도록록 넣는다 - 실온에 5분간 정치한다 - Pestle로 마쇄한다(약30초~1분) - 짧게 spindown하여 새튜브에(60ul정도)옮긴다 - 3ul를 Biocube에 drop한다 - 3분후 여액을 제거한다 A : 식충식물1 B : 식충식물2(잎) C : 식충식물2(줄기) <그림 2. 실험과정> PCR 수행 및 염기서열 결정 종 류 용량 Biocube 1 Primer1(10pmole) 1ul Primer2(10pmole) 1ul D.W. 8ul 2X PCR Mix 10ul Reaction 20ul 구분 온도 시간 반복 Initial Denaturation 95℃ 5m 1 Denaturation 95℃ 20s 35 Annealing 60℃ 20s Extension 72℃ 30s Elongation 72℃ 5m 1 Storage 4℃ - - - CLUSTAL W를 이용하여 multiple alignment, Mega 6 program, CLC workbench - NCBI GenBank(미국국립생물정보센터) Nucleotide Blast 검색을 이용 하여 기존에 공개되어진 염기서열과 본 연구에서 얻어진 염기서열을 비교하여 확인절차 수행 Ⅲ 추 진 결 과 c 식충식물 종 동정을 위한 DNA 바코드 데이터 연구 - 전 세계적으로 약 300,000종의 식물 종(species)이 동정(identification)되어 있지만 여전히 많은 종의 동정이 명확하지 않음 - 종 동정이나 분류의 정확성을 높이기 위해 활용되는 것이 바로 DNA 바코드(DNA barcode)이며, 기존의 범용 성 DNA 바코드(ITS, matK, rbcL, trnL-F)는 식물 종 동 정에 중추적 역할을 함 - DNA 바코드 데이터베이스는 BOLDSYSTEM과 GenBank가 대표적이며 이들을 활용한 DNA 바코드 분석이 가능 식물 엽록체에 존재하는 유전자 rbcL(ribisco Large)분석 결과 rbcL gene의 부분 염기서열 300bp와 814bp 확보 그림 3. sequencing결과의 chromatogram >Dosera1_300bp TTAACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCCTAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACCCCGCAACCAGGAGTTCCACCAGAAGAAGCAGGAGCAGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGCCTTGATCGTTACAAGGGGCGATGCTACCACATTGAGCCTGTTGCTGGTGAAGACAATCAATATATTGTTTATGTAGCTTACCCATTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTT >Dosera2_814bp TGCTTATGTAGCTTATCCATTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCTCTGCGTGCTCTACGTTTGGAGGATTTGCGAATCCCTCCTTCTTATATAAAAACTTTCCAAGGCCCACCTCACGGTATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAATATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTAGGGTTATCTGCGAAGAACTATGGCCGAGCAGTTTATGAATGTCTTCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAAGATGATGAAAACGTTAACTCCCAACCATTTATGCGTTGGAGAGACCGTTTCTTATTTTGTGCAGAAGCACTTTATAAAGCCCAGGCAGAAACTGGTGAAATCAAAGGGCATTACTTGAATGCTACTGCCGGGACATGCGAAGAGATGATAAAAAGGGCTGTATTTGCCAGAGAACTGGGAGTTCCTATCGTAATGCATGACTACTTAACAGGAGGATTCACCGCAAATACTAGCTTGGCTCAGTATTGTCGAGATAATGGACTACTTCTTCACATCCACCGTGCAATGCATGCCGTTCTTGATAGACAGAAGAATCATGGTATACATTTCCGTGTACTAGCTAAAGCCTTACGTCTGTCTGGTGGCGATCATATTCATTCTGGAACCGTAGTAGGTAAACTGGAAGGGGAACGAGACATCACCTTAGGCTTCGTTGATTTATTACGTGATGATTTTATTGAAAAAGACAGAACTCGCGGTATTTATTTCACCCAACCTTGGGTT 그림 4. sequencing결과 확인된 염기서열 그림 5. NCBI의 BLAST search 결과 Nucleotide Blast Search 결과, 가장 높은 상동성을 보인 염기서열을 지닌 종은 아래의 표와 같음 가장 높은 상동성을 보인 종 상동성 Drosera rotundifolia 813/814(99.8%) Drosera brevifolia 811/814(99.6%) Drosera anglica 810/814(99.5%) Drosera felix 809/814(99.3%) 가장 높은 상동성을 보인 종 상동성 Drosera peltata 300/300(100%) Drosera auriculata 298/300(99.3%) Drosera erythrorhiza 297/300(99%) Drosera aberrans 297/300(99%) 분석대상 식충식물 2점은 Drosera rotundifolia(끈끈이주걱)과 Drosera peltata(끈끈이귀개)으로 추정되지만 rbcL 유전자의 종간 변이 율이 크지 않아 끈끈이과 식물의 종 구분을 하기에 부적합함. 종간 변이를 고려하여 적합한 엽록체 바코드 marker(metK, trnH-psbA)를 발굴하고 재분석할 필요성이 있음 Ⅳ 향 후 계 획 c rbcL 유전자는 phylogenic analysis에 널리 사용되는 DNA 바코드이지 만 divergence가 낮고 분화가 느려 species 수준의 DNA 바코드로 활용하기 어렵운 점이 있음 따라서 추후에 다른 종류의 DNA바코드(matK, trnH-psbA) 와의 조합을 통해 끈끈이주걱과 식물의 종간 구분에 적합한 maker 확립 필요 Ⅴ 참 고 문 헌 c F.Demattia, I.Bruni, A.Galimberti, F.Cattaneo, M.Casiraghi, and M.Labra, “Acomparative study of different DNA barcoding markers for the identification of some members of Lamiacaea”, Food Research International, vol.44, no.3, pp.693-702, 2011 박인규(2017)., 식물 DNA 바코드 데이터 생산 및 연구 동향, BRIC VIEW 2017-T05(Feb 14, 2017) 함초혜(2012)., DNA 바코딩을 이용한 캄보디아와 미얀마 식물의 동정.끝.

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