서울特別市 保健環境硏究院報 第50號	(2014)

Report of S.I.H.E., 50:287~300	(2014)

서울지역 다중이용시설에서 분리한 레지오넬라균의 분자역학적 조사(2012-2014)

감염병검사팀

전수진․이성득․정지헌․진영희․정효원․김영은․김경식․오영희․정  권

Molecular Epidemiology of Legionella Pneumophila Isolated from Water Supply Systems in Seoul, Korea, from 2012 to 2014

Infectious Disease Team

Su-jin Jeon, Sung-deuk Lee, Ji-hun Jung, Young-hee Jin,

Hyo-won Jeong, Young-eun Kim, Kyung-sik Kim,

Young-hee Oh and Kweon Jung

Abstract

Legionella is a pathogenic bacterial genus associated with aquatic habitats of natural and artificial environments. Some species of Legionella are recognized as potential opportunistic human pathogens, notably Legionella pneumophila, which causes Legionellosis. We collected 3,140 water samples between 2012 and 2014 from water supply systems(cooling towers, public baths, hospitals, and decorative fountains) in Seoul, Korea, which were considered as major habitats of L. pneumophila. From these 3,140 samples, 493(15.7%) isolates of L. pneumophila were obtained by microbial culture and polymerase chain reaction(PCR). The existence of the 16S rRNA and mip genes of L. pneumophila was confirmed in the genome of the isolated strains by PCR. The cooling towers and public baths had the most samples with L. pneumophila. Among the 176 isolates of L. pneumophila from the cooling tower samples, 136 belonged to serogroup 1(77.3%), 12 belonged to serogroup 6(6.8%), 9 belonged to serogroup 5(5.1%), 8 belonged to serogroup 2(4.5%), and 4 belonged to serogroup 3(2.3%). Upon pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) analysis using SfiI, the genetic types of L. pneumophila from the cooling towers were classified into 4(A to D) patterns by band similarity with excess of 70%. The PFGE patterns of the serotypes showed a tendency for diversity among L. pneumophila. Our results suggest the existence of serological and genetic diversity among the L. pneumophila isolates.

Key words : Legionella pneumophila, cooling towers, Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)

서  론

Legionella pneumophila(L. pneumophila)는 1976년 미국 필라델피아에서 집단 발생한 폐렴의 원인균으로 확인된 이후 미국은 물론 세계 각국에서 다수의 산발적인 발생 뿐만 아니라 집단적으로 발생한 예가 보고되고 있다. 특히 우리와 가까운 일본에서는 수 차례에 걸친 집단 발병 예가 있었는데 2002년에는 온천에서 300명 이상이 L. pneumophila에 감염되고 8명이 사망하는 예까지 있었다. 2000~2009년 미국 National Notifiable Disease Surveillence System(NNDSS)에 의하면 레지오넬라증은 2009년도에 3,522건이 발생하였고, 2000년도 발생건수 1,110건보다 무려 217% 증가하여 인구 10만명당 1.15명이 발병하였다. 유럽에서는 2010년도 6,296건의 레지오넬라증이 발생하여 인구 10만명당 1.24명이 발병하였으며, 특히 프랑스, 이탈리아, 스페인이 62.3%를 차지하였다. 유럽 역시 2000년까지 인구 10만명당 0.5명 이하였던 것이 2001년 이후로 발병률이 계속 증가하고 있다. 그러나 다행히 우리나라에서의 집단 발병 예로는 1984년 서울 소재 종합병원 중환자실에서 발생한 이후로는 산발적으로 발생한 예들이 보고되고 있을 뿐 큰 집단 감염은 없었다(1~5).

레지오넬라속균(Legionella spp.)은 자연계의 토양을 비롯한 하천과 호수에서 서식하는 그람음성 막대균으로 편모를 가지고 있어 운동성이 있다. 레지오넬라 감염은 대개 불현성으로 진행되며, 임상증상은 독감과 유사한 증상을 나타내는 폰티악열과 중증의 폐렴을 나타내는 레지오넬라증(재향군인병)의 두 가지 형태로 나타난다. 레지오넬라증의 발병은 면역억제제 치료자, 수술환자, 알코올중독자, 흡연자, 노약자 등 면역력이 떨어진 개체에 치명적이며, 사람에서 사람으로의 감염은 일어나지 않고 사람만이 유일한 자연숙주로 알려져 있다(6).

레지오넬라균속에는 현재 48개의 종(species)과 70개의 혈청형이 존재하며, 분리율이 가장 높은 L. pneumophila를 비롯하여 20종이 사람에게 질병을 일으킨다. 이 중 L. pneumophila serogroup 1은 세계적으로 레지오넬라증을 일으키는 원인균의 95%를 차지하고, 그 subtype도 다양하다. 이런 다양한 L. pneumophila serogroup의 sub- typing을 기존에는 생물학적 cysteine 요구성, 자가형광 또는 생화학적 성상 등에 근거하여 시행하여 왔다. 그러나 최근에는 분자생물학적 방법들이 발달하면서 연쇄중합반응(PCR)과 연계한 유전학적 균종 동정이 손쉬워 많이 사용되고 있고, 유전자 염기서열 분석 같은 방법은 균종 동정과 특정 균종 typing에도 흔히 사용되고 있다(7~8). 이런 다양한 L. pneumophila serogroup의 subtyping에는 단클론 항체 typing, plasmid 분석, mul- tienzyme 또는 alloenzyme electrophoresis, restriction fragment length polymorphism, ribotyping 및 pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)와 같은 macrorestriction enzyme digestion 등이 이용되고 있다. 특히, 제한효소 sfiⅠ이나 NotⅠ을 이용한 PFGE는 변별력이 가장 좋은 방법으로 집단 발병 시 역학조사에 사용하는 중요한 방법으로 감염원 추적 또는 동일 원인균 여부 판정 등에 사용할 수 있다(9).

본 연구에서는 사람에 대한 병원성과 연관성이 깊고 다른 레지오넬라균에 대하여 L. pneumo- phila를 구별할 수 있게 하는 표적 유전자인 mip (macrophage infectivity potentiator)을 이용하였다. mip는 초기에 macrophage 내 감염을 효과적으로 일으키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(10~14).

L. pneumophila는 여러 가지 경로를 통하여 인공의 수계시설로 유입되면서 레지오넬라 질환의 발생이 증가하고 있다. 인공의 수계시설로는 건물의 냉각 순환수로 사용되는 냉각탑수를 비롯하여, 목욕탕수, 분수 등이 있으며, 불특정 시민들이 이용하는 이러한 다중이용시설의 증가로 인하여 이들 시설을 통한 감염이 우려되고 있으므로, 이들 다중이용시설에 대한 주기적인 감시 강화가 필요할 것으로 생각된다(15~16).

따라서 본 연구는 서울시 레지오넬라증 예방관리사업의 일환으로 서울지역 레지오넬라균의 주요 서식지인 냉각탑, 목욕탕, 병원, 분수대 등에서 채취한 환경검체로부터 레지오넬라균을 분리동정하고, 분자생물학적 특성을 분석하였다. 레지오넬라증의 가장 큰 원인균인 L. pneumophila의 혈청학적, 분자생물학적 특성을 연구함으로써 역학조사 자료를 축적하고 서울지역에서 레지오넬라균의 분포 특성을 파악하여 레지오넬라증 집단발생원인을 조기에 발견하고 질병확산 예방 및 재발방지를 구현하는데 기여하고자 한다.

재료 및 방법

1. 시료채취

2012년부터 2014년까지 3년간 서울지역의 대형건물, 병원, 대형목욕탕, 호텔, 분수 등의 다중이용시설에 대해 냉각탑수, 목욕탕수, 분수 등을 대상으로 총 3,140건에 대하여 L. pneumophila 검출 실험을 실시하였다.

2. 균주의 분리 및 동정

Table 1. Primers used in this study

Primer	Sequence(5' → 3')	Product size
16S rRNA	F:AGGGTTGATAGGTTAAGAGG R:CAACAGCTAGTTGACATGG	386 bp
mip	F:GGTGACTGCGGCTGTTATGG R:GGCCAATAGGTCCGCCAACG	630 bp

채취시료 1 L를 여과지(0.2 [eqn: mu]m)를 통과시켜 균을 모은 후 여과지를 잘게 잘라 멸균증류수 20 ml에 넣어서 강하게 와류시킨 다음, 50℃에서 30분간 열처리한 후 이것을 검액으로 사용하였다. 검액 0.1 ml와 0.01 ml을 GVPC(glycine-vancomycin- polymyxin B-colisitin)를 첨가한 BCYE-[eqn: alpha](buffered charcoal yeast extract-[eqn: alpha]-ketoglu- tarate, Difco, Sparks, USA) 선택배지에 각각 도말하고, 37℃에서 7일간 배양하였다. 3일째부터 자란 집락 중 회백색이고, 약간 투명감이 있고, 습윤한 집락으로 특유의 신냄새가 있고 해부현미경 상에서 cut-glass의 형태를 띄는 집락에 대하여 그람염색을 시행하였다. 그람음성 막대균으로 확인된 집락을 다시 BCYE-[eqn: alpha] 한천배지와 L-cysteine(Difco, Sparks, USA)이 결핍된 BCYE-[eqn: alpha] 한천배지 및 혈액한천배지에 각각 계대배양하였다. L-cysteine은 성장을 자극하는 역할을 한다. BCYE-[eqn: alpha] 한천배지에서는 발육하고 L-cysteine 결핍된 BCYE-[eqn: alpha] 한천배지 및 혈액한천배지에서는 발육하지 않는 그람음성 막대균을 레지오넬라균으로 일차 동정하였다(17).

3.  PCR (Polymerase chain reaction)에 의한 mip 유전자 검출

PCR에 사용한 Primer는 레지오넬라균속에 특징적인 16S rRNA primer set(F: 5'-AGGG TTGATAGGTTAAGAGG-3', R: 5'-CAACAGC TAGTTGACATGG-3')과 L. pneumophila 균종에 특이적인 mip 유전자 Primer set(F: 5'-GG TGACTGCGGCTGTTATGG-3', R: 5'-GGCCA ATAGGTCCGCCAACG-3')을 사용하였다(***).

가열법으로 추출한 DNA를 GeNeT Bio premix (Genet Bio, Korea)를 사용하여 97℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초를 30회 반복하고 최종 72℃에서 5분간 증폭시켰다. 이 PCR산물을 1.5% agarose gel을 이용하여 25분간 전기영동한 후 16S rRNA 및 mip 유전자의 증폭유무를 확인하였다(그림**).

Fig.  1.  Gel electrophoresis of PCR products of mip gene(630 bp) and 16S rRNA (386 bp) on 1.5% agarose gel. M was 100 bp DNA ladder. All lanes(1~15) were showed bands of correct size for L. pneumophila.

4. 분리균주의 혈청학적 동정

분리된 L. pneumophila 시험균주를 다시 BCYE -[eqn: alpha] 한천배지에서 배양 후, serotyping kit (Denka Seiken, Japan)을 사용하여 혈청형을 확인하였다. 생리식염수에 시험균을 현탁시킨 다음 100℃에서 1시간 또는 120℃에서 15분간 가열처리한 후, 슬라이드 응집 시험법에 의한 항혈청-항원액 반응으로 혈청형을 결정하였다.

5. Pulsed field gel electrophoresis(PFGE)

Fig.  2.  Five regional zones in Seoul. Dark background colors indicates the large areas.

BCYE-[eqn: alpha] 한천배지에서 72시간 배양한 실험균주를 cell suspension용 TE buffer(100 mM Tris, 100 mM EDTA, pH 7.5)에 현탁하여 탁도를 20% 정도로 조정한 후, 균 현탁액 200 μl에 1.2% agarose solution을 동량 첨가하여 plug mold에서 4℃, 5분간 성형시켰다. Proteinase K(20 mg/ml stock) 40 [eqn: mu]l와 ES buffer 1.5 ml의 혼합액에 굳힌 plug을 넣어서 55℃ 진탕 항온수조에서 2시간 동안 처리한 후, 55℃의 멸균증류수로 15분간 1회, 55℃의 Plug Wash TE buffer로 30분간 5회 세척하였다. 세척이 끝난 plug를 1 mm 두께로 자른 다음, Sfi I이 첨가된 반응 혼합액에 넣어 50℃ 항온수조에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 plug를 gel 성형용 comb에 위치시킨 다음, 1% agarose를 gel 성형틀에 부어 굳힌 다음 CHEF Mapper PFGE system(BioRad, USA)를 이용하여 gradient 6.0 V/cm, included angle 120°, initial time 2.16초, final time 54.17초의 조건으로 14℃에서 18시간 동안 전기영동을 실시하였다. EtBr(0.5 [eqn: mu]g/mL) 용액에서 gel을 20분간 염색한 후, 증류수로 탈색과정을 거친 다음 transilluminator를 이용하여 밴드를 확인하였다. PFGE 결과 분석을 위하여 Bio- Numerics software(Applied Maths, Belgium) version 3.5를 이용하여 dendrogram을 작성하였다(18).

결  과

1. L. pneumophila 검출결과

1) 검체별 L.pneumophila 검출결과

배양 및 PCR방법을 이용하여 2012년부터 2014년까지 채취한 시료 3,140건에 대하여 L. pneumophila 확인검사를 실시한 결과 2012년에는 122건(11.8%), 2013년에는 191건(17.5%), 2014년에는 180건(17.7%)이 검출되어 평균 검출율은 15.7%를 나타내었다. 검체종류별로 살펴보면 대형목욕탕, 찜질방의 목욕수는 1,053건 중 224건(21.3%), 대형건물, 대형쇼핑센터, 병원, 호텔등의 냉각탑수는 926건 중 176건(19.0%), 병원은 835건 중 85건(10.2%), 분수대는 74건 중 2건(2.7%), 기타 252건 중 6건(2.4%)으로 각각 검출되었다. 매년 목욕수와 냉각탑수가 가장 많이 의뢰되었으며 검출률 또한 목욕수와 냉각탑수가 가장 높았으며 나머지는 병원, 분수대, 기타시설 순으로 검출되었다(***). 2012년보다 2013년과 2014년의 검출률이 높게 나온 것은 검출률이 높은 대형목욕탕의 의뢰건수가 증가되었기 때문인 것으로 판단된다.

2) 권역별 L. pneumophila 검출현황

서울시를 서북권, 도심권, 동북권, 서남권, 동남권 5개의 권역으로 나누어 비교하였다(*****). ****에서 7개의 많은 자치구를 가지고 있는 서남권이 가장 높은 19.8%의 검출률을 보였다. 반면

Table 2. The number of positive samples for L. pneumophila isolates from public facilities in Seoul over 3 years
Year	Isolates(%)a					Total
	Cooling Tower	Public Bath	Hospital	Fountain	Others
2012	55/317(17.4)	49/286(17.1)	16/323(5.0)	2/25(8.0)	0/82(0.0)	122/1033(11.8)
2013	66/320(20.6)	101/396(25.5)	24/270(8.9)	0/24(0.0)	0/82(0.0)	191/1092(17.5)
2014	55/289(19.0)	74/371(19.9)	45/242(18.6)	0/25(0.0)	6/88(6.8)	180/1015(17.7)
Sub Total	176/926(19.0)	224/1053(21.3)	85/835(10.2)	2/74(2.7)	6/252(2.4)	493/3140(15.7)b
a Water sampling for cooling towers was done at the cooling tower basins of large-scale shopping malls, department houses, hotels, large buildings and hospitals ; at public bath houses in taps, showers and hot tubs ; and at hospitals in toilets and showers. The fountains were decorative fountains in parks and squares. b The average detection rate

Table 3. The number of positive rate for L. pneumophila isolated from northwestern boroughs in Seoul
Borough	Year	Isolates(%)	Sub Total(%)	Total(%)
Eunpyeong	2012	13/57(22.8)	28/159(17.6)	62/410(15.1)
	2013	5/59(8.5)
	2014	10/43(23.3)
Seodaemun	2012	6/44(13.6)	16/126(12.7)
	2013	4/43(9.3)
	2014	6/39(15.4)
Mapo	2012	7/41(17.1)	18/125(14.4)
	2013	3/39(7.7)
	2014	8/45(17.8)

Table 4. The number of positive rate for L. pneumophila isolated from downtown boroughs in Seoul
Borough	Year	Isolates(%)	Sub Total(%)	Total(%)
Jongno	2012	4/37(10.8)	15/120(12.5)	59/369(16.0)
	2013	4/42(9.5)
	2014	7/41(17.1)
Jung-gu	2012	4/36(11.1)	26/128(20.3)
	2013	14/44(31.8)
	2014	8/48(16.7)
Yongsan	2012	10/44(22.7)	18/121(14.9)
	2013	5/41(12.2)
	2014	3/36(8.3)

Table 5. The number of positive rate for L. pneumophila isolated from northeastern boroughs in Seoul
Borough	Year	Isolates(%)	Sub Total(%)	Total(%)
Seongdong	2012	2/40(5.0)	24/123(19.5)	142/951(14.9)
	2013	14/49(28.6)
	2014	8/34(23.5)
Gwangjin	2012	3/38(7.9)	13/117(11.1)
	2013	9/43(20.9)
	2014	1/36(2.8)
Dongdaemun	2012	3/38(3.6)	15/123(12.2)
	2013	5/45(11.1)
	2014	7/40(17.5)
Jungnang	2012	3/35(8.6)	35/128(27.3)
	2013	11/45(24.4)
	2014	21/48(43.8)
Seongbuk	2012	0/35(0.0)	12/113(10.6)
	2013	8/41(19.5)
	2014	4/37(10.8)
Gangbuk	2012	2/36(5.6)	11/117(9.4)
	2013	1/39(2.6)
	2014	8/42(19.1)
Dobong	2012	2/36(5.6)	11/114(9.7)
	2013	2/38(5.3)
	2014	7/40(17.5)
Nowon	2012	5/38(13.2)	21/116(18.1)
	2013	7/37(18.9)
	2014	9/41(22.0)

Table 6. The number of positive rate for L.pneumophila isolated from southwestern boroughs in Seoul
Borough	Year	Isolates(%)	Sub Total(%)	Total(%)
Yangcheon	2012	9/56(16.1)	29/130(22.3)	174/881(19.8)
	2013	10/37(27.0)
	2014	10/37(27.0)
Gangseo	2012	4/40(10.0)	23/124(18.5)
	2013	13/46(28.3)
	2014	6/38(15.8)
Guro	2012	3/37(8.1)	26/125(20.8)
	2013	16/44(36.4)
	2014	7/44(15.9)
Geumcheon	2012	7/29(24.1)	30/115(26.1)
	2013	12/46(26.1)
	2014	11/40(27.5)
Yeongdeungpo	2012	4/39(10.3)	12/113(10.6)
	2013	2/36(5.6)
	2014	6/38(15.8)
Dongjak	2012	6/40(15.0)	25/140(17.9)
	2013	9/60(15.0)
	2014	10/40(25.0)
Gwanak	2012	8/46(17.4)	29/134(21.6)
	2013	14/44(31.8)
	2014	7/44(15.9)

Table 7. The number of positive rate for L. pneumophila isolated from southeastern boroughs in Seoul
Borough	Year	Isolates(%)	Sub Total(%)	Total(%)
Seocho	2012	3/42(7.1)	11/124(8.9)	55/513(10.7)
	2013	5/42(11.9)
	2014	3/40(7.5)
Gangnam	2012	9/48(18.8)	19/130(14.6)
	2013	10/48(20.8)
	2014	0/34(0.0)
Songpa	2012	4/60(6.7)	14/143(9.8)
	2013	6/40(15.0)
	2014	4/43(9.3)
Gangdong	2012	1/39(2.6)	11/116(9.5)
	2013	2/37(5.4)
	2014	8/40(20.0)

진한 바탕색의 동남권은 자치구당 면적이 가장 넓지만 가장 낮은 10.7%의 검출률을 보였다. 그러나 자치구 면적이 넓은 강서구와 노원구는 높은 검출률을 보였다. 즉 면적과 L. pneumophila 발생과는 상관관계가 없음을 확인할 수 있었다. L. pneumophila 발생과 인구밀도가 미치는 영향을 조사하였다. 서울시는 전국에서도 가장 밀집도가 높은 도시이지만 자치구별로 인구분포가 다르다(****). 인구밀집도를 살펴보면 그림 3에서 진한 바탕색의 양천구, 동대문구, 동작구 순으로 높지만, 2012~2014년 3년간 L. pneumophila가 많이 검출된 자치구는 중랑구, 금천구, 양천구 순으로 각각 검출률이 27.3%, 26.1%, 22.3%를 나타냈다. 따라서 인구밀도와 L. pneumophila 발생과도 상관관계가 없음을 확인할 수 있었다.

Table 8. Serotyping of L. pneumophila strains isolated from cooling towers in Seoul
Species	Serogroup	Number of isolates(%)
		2012	2013	2014
L. pneumophila	1	41	52	43
	2	3	2	3
	3	1	2	1
	4	0	0	0
	5	3	3	3
	6	5	4	3
Total		53	63	53

27.3%

26.1%

22.3%

Fig.  3.  Relationship between the population density and the detection rate for L. pneumophila. Dark background colors indicates the high population density.

2. 분리균주의 혈청형

2012년부터 2014년까지의 서울지역 다중이용시설 중 높은 검출율을 보인 냉각탑수에 대한  926건에 대하여 L.  pneumophila 배양검사를 실시하였다. 그 결과 176건(19.0%)에서 L. pneumophila가 검출되었으며 분리동정된 L. pneumophila의 혈청형 분포는 1형이 136주(77.3%), 6형이 12주(6.8%), 5형이 9주(5.1%), 2형이 8주(4.5%), 3형이 4주(2.3%), 4형은 검출되지 않았으며 7주가 6가지 혈청형에 반응이 일어나지 않았다(***).

3. 분리균주의 PFGE 패턴 분석

L. pneumophila의 패턴 분석에는 NotⅠ을 사용하는 것보다 SfiⅠ을 사용하는 것이 세분화된 분류를 하기에는 변별력이 있다고 한 Park 등(19)의 결과를 토대로 SfiⅠ 제한효소를 이용하였다. 2013년부터 2014년까지의 서울시 다중이용시설 중 대형건물, 대형쇼핑센터, 호텔 등 냉각탑수에서 분리된 L. pneumophila sg 1으로 분리동정된 77건에 대해 PFGE를 실시하였다. 우선 2013년 38개 분리균주를 PFGE pattern을 dendro- gram으로 나타낸 분석 결과, 70% 이상의 상동성을 기준으로 A~D까지 4개의 유형으로 분류되었다(****). 이를 다시 85% 이상의 상동성을 기준으로 A유형은 A1~A4, B유형은 B1~B2, C유형은 C1~C6의 subtype, D유형은 D1 subtype으로 분류되었다. C유형이 47.4%로 가장 많은 부분을 차지하였고, A유형이 42.1%, B유형 7.9%, D유형 2.6%순으로 분류되었다. A유형은 금천구, 성동구, 강남구등 같은 자치구별로의 상동성이 높게 나타났으며 C유형의 경우 중랑구, 송파구, 도봉구 등 같은 자치구들과의 상동성도 높게 나타났지만 다른 지역의 균주와도 높은 상동성을 보이는 것도 있어서 동일 유래균이 서울전역에 넓게 분포되고 있는 것으로 추정할 수 있다.

2014년 39개 분리균주를 PFGE pattern을 분석한 결과, 70% 이상의 상동성을 기준으로 A~D까지의 4개의 유형으로 분류되었다(****). 이를 다시 85% 이상의 상동성을 기준으로 A유형은 A1~A6, B유형은 B1~B2, C유형은 C1~C8, D유형은 D1~D2 subtype으로 분류되었다. A유형이 41.0%로 가장 많은 부분을 차지하였고, 다음은 C유형으로 38.5%, B유형과 D유형은 각각 12.8%, 7.7% 순으로 분류되었다. A유형의 경우 구로구와 종로구간에도 높은 유연관계를 나타내고 있고, 한강을 사이에 두고 강남, 강북지역간 몇몇 지역에서 90% 이상의 상동성을 보이는 곳도 있어, 전체 분리균주의 유전자형별의 지역적 분포가 다양하게 나타남을 알 수 있다. C유형은 관악구, 성동구 등 같은 지역끼리의 상동성이 높게 나타났으며, B유형은 금천구가 대부분을 차지하였고, D유형은 노원구가 우세하게 분류되었다. 이러한 결과를 통해 같은 지역의 상동성이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며 또한 같은 유래균주가 다른 지역의 균주들과도 높은 유연관계로 나타났다. 이는 같은 유래균주가 넓게 분포되어 있는 것으로 추정할 수 있다.

고  찰

레지오넬라균의 오염 가능성이 있는 수계환경에 대하여 오염여부를 조사하여 효율적인 소독 및 관리방안을 제시하고 분리된 레지오넬라균에 대한 유형을 분석하여 환자 발생시 비교 가능한 데이터를 확보하는 것은 레지오넬라증 예방관리에 있어 중요한 일이라 생각된다. 이에 본 연구에서는 2012년부터 2014년까지의 서울지역 다중이용시설 수계환경검체 총 3,140건에 대한 레지오넬라 검사를 실시한 결과 493건의 레지오넬라균이 검출되어 15.7%의 검출률을 나타내었다. 각 검체별 오염도는 대형목욕탕, 찜질방의 목욕탕수 21.3% [eqn: >] 대형건물, 대형쇼핑센터, 호텔, 병원의 냉각탑수 19.0% [eqn: >] 병원 10.2% [eqn: >] 분수대 2.7% [eqn: >] 기타시설 2.4% 순으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 목욕탕수의 경우 레지오넬라균의 생존온도인 25~45℃의 환경을 갖춘 온수시설 등에서 감염기회가 높아진 것으로 볼 수 있다. 냉각탑수의 경우, 냉각탑으로 인한 레지오넬라증은 과거부터 많이 발생한 예를 볼 수 있다. 이러한 냉각탑 주변은 레지오넬라균 오염의 진원지가 되기 쉬운데, Bhopal(20)는 냉각탑 근처에 사는 주민들에 대해 레지오넬라증을 조사한 결과에서 1 km이내 사는 사람들보다 0.5 km이내에 거주하는 주민들이 3배 이상 감염되기 쉽다고 발표하였다. 심지어 미국 위스콘신에서는 냉각탑과 1.6 km에 떨어져 있는 거주민에서도 레지오넬라증(혈청형 1형)을 확인하였다(21). 냉각탑은 주로 건물옥상이나 노출된 공간에 설치되어 있어 태양광으로 인한 온도상승과 개방된 구조로 인한 외부 자연환경계에 존재하는 레지오넬라균의 유입이 용이하여 이들이 증식할 수 있는 좋은 조건이라 높게 검출된 것으로 볼 수 있다.

레지오넬라균속에는 48개의 종(species)과 70개의 혈청형이 있으며 레지오넬라증의 80~90%가 L. pneumophila에 의한 것으로 알려져 있다. L. pneumophila에는 15개의 혈청군이 존재하는데, 그 중에서 L. pneumophila sg 1이 레지오넬라증 환자의 주요 원인병원체이며, 수계환경에서도 가장 높은 분포율을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 국내 논문의 경우 혈청형 분포에서 Whang 등

Fig. 4. Dendrogram showing the clustering of PFGE patterns of isolated strains of L. pneumophila sg 1 after Sfi Ⅰ digestion in 2013.

Fig.  5.  Dendrogram showing the clustering of PFGE patterns of isolated strains of L. pneumophila sg 1 after Sfi Ⅰ digestion in 2014.

(22)과 Kim 등(23)은 서울시내 냉각탑수에서 분리된 L. pneumophila의 혈청형 1형이 각각 87.4%와 86.4%로 보고하였고, 본 연구에서도 L. pneumophila의 혈청형 1형이 77.3%로 가장 높게 검출되었다. 한편 Kim 등(24)과 Kim 등(25)의 결과와 비교해 볼 때 4형은 여전히 검출되지 않았다.

서울시는 전국에서도 가장 밀집도가 높은 도시이지만 자치구별로 인구분포가 다르기 때문에, 인구밀도가 L. pneumophila 발생에 미치는 특징이 있을 것으로 예상하였다. 하지만 인구밀도가 높은 자치구와 낮은 자치구 사이에 통계적으로 유의한 차이를 찾아내지는 못하였다. 중랑구, 금천구, 양천구 순으로 L. pneumophila가 많이 발생하였는데, 이들 자치구는 인구밀도가 높지 않은 지역인데도 불구하고 높은 L. pneumophila 검출율을 보여 인구밀도와 직접적인 영향이 없는 것으로 나타났다. 즉, 인구밀도와 L. pneumophila 발생과는 상관관계가 없음을 확인하였다. 이는 사람간의 감염전파 사례가 없다(26)는 발표들과도 관계가 있는 내용이고, 오히려 인구밀도보다는 시설별로 나타나는 L. pneumophila 발생특징을 이용하는 것이 오염원과 오염과정을 파악하는데 바람직하다는 사실을 보여주고 있다.

서울시 다중이용시설 중  대형건물, 대형쇼핑센터, 호텔 등 냉각탑수에서 분리된 L. pneumophila sg 1으로 확인된 77건의 분리균주를 대상으로 분자생물학적 유연관계를 알아보고자 PFGE를 실시한 결과 같은 혈청형이라 할지라도 다른 subtype으로 나타나는 경우로 미루어 보아 Legionella spp.가 유전적으로 다양하게 분화되어감을 추측할 수 있다. 또한 같은 지역내의 수계시설간의 상동성이 높게 나타났으나, 다른 지역간의 상동성도 높게 나타나는 것도 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 Lee 등(27)의 결과와 마찬가지로 서울전역에 L. pneumophila subtype이 광범위하게 퍼져 있음을 알 수 있다.

환경수계에서 분리되는 레지오넬라균에 대한 노출이 증가하고 있는 시점에서 환경뿐만 아니라 인체에서 분리한 L. pneumophila을 함께 연구하고, 이들 분리균주에 대한 유전자 pattern 분석결과를 데이터를 베이스화하여 레지오넬라증의 집단 발생 또는 산발적인 질병 발생이 있을 경우 감염원과 감염경로의 파악 및 대책수립에 유용한 자료를 제공할 수 있을 것이다.

결  론

2012년부터 2014년까지의 서울지역 다중이용시설에서 분리된 레지오넬라균에 대해 혈청형 검사, PCR법을 이용한 16S rRNA 및 L. pneumophila에 특이적으로 존재하는 mip 유전자 확인검사와 PFGE 분석을 실시하였다.

1.  검체종류별로 살펴보면 대형목욕탕, 찜질방의 목욕수는 1,053건 중 224건(21.3%), 대형건물, 대형쇼핑센터, 병원, 호텔등의 냉각탑수는 926건 중 176건(19.0%), 병원은 835건 중 85건(10.2%), 분수대는 74건 중 2건(2.7%), 기타 252건 중 6건(2.4%)으로 각각 검출되었다.

2.  서울시를 서북권, 도심권, 동북권, 서남권, 동남권 5개의 권역으로 나누어 비교한 결과 자치구 면적, 인구밀도와 L. pneumophila발생과는 상관관계가 없음을 확인하였다

3.  분리동정된 L. pneumophila의 혈청형 분포는 1형이 136주(77.3%), 6형이 12주(6.8%), 5형이 9주(5.1%), 2형이 8주(4.5%), 3형이 4주(2.3%), 4형은 검출되지 않았으며 7주가 6가지 혈청형에 반응이 일어나지 않았다.

4.  냉각탑수에서 분리된 L. pneumophila sg 1으로 분리동정된 77건에 대해 PFGE 분석을 한 결과 70% 이상의 상동성을 기준으로 A~D까지 4개의 유형으로 분류되었다. 이를 다시 85% 이상의 상동성을 기준으로 2013년 분리된 균주는 13개의 subtype, 2014년 분리된 균주는 18개의 subtype으로 분류되었다.

참고문헌

1.  Lee, MH, Lauri, AH and George, EN : Legionellosis-United States, 2000-2009. Am J Transplant, 12:250~253, 2012.

2.  European Centre for Disease Prevention and Control : Legionnaires’ disease in Europe 2010. 2012.

3.  Miyamoto, H : Prevention measures against Legionella infection in a circulating hot water bath. J UOEH, 25:61~77, 2003.

4.  Kim, JS, Lee, SO, Shim, HS, Oh, TK, Cho, MK and Oh, HB : An outbreak of Legionellosis in ICU of K Hospital, Korea. Korean J Epidemiol, 7:44~58, 1985.

5. Choe, KW, Kim, SM, Kim, YS, Kim, HJ and Woo, JH : A case of Legionnaires’ disease. Korean J Inf Dis, 22:93~96, 1990.

6.  Fields, BS, Benson, RF and Besser, RE : Legionella and Legionnaires' disease 25 Years of investigation. Clin Microbiol Rev, 15:506~526, 2002.

7. Winn, WC : Legionella. In Murray, P. R. (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. Washington. American Society for Microbiology, 2007.

8.  Atlas, RM : Legionella from environ- mental habitats to disease pathology, detection and control. Environ Microbiol, 1:283~293, 1999.

9.  Schoonmaker, D, Heimberger, T and Birkhead, G : Comparison of ribotyping and restriction enzyme analysis using pulsed-field gel electrophoresis for distinguishing Legionella pneumophila isolates obtained during a nosocomial outbreak. J Clin Microbiol, 30:1491~ 1498, 1992.

10.  Nintasen, R, Utrarachkij, F, Siripanichgon, K, Bhumiratana, A, Suzuki, Y and Suthienkul, O : Enhancement of Legionella pneumophila culture isolation from micro- environments by macrophage infectivity potentiator(mip) gene-specific nested polymerase chain reaction. Microbiol Immunol, 51:777~785, 2007.

11.  Amemura-Maekawa J, Kura F, Chang, B and Watanabe, H : Legionella pneumophila serogroup 1 isolates from cooling towers in Japan form a distinct genetic cluster. Microbiol Immunol, 49:1027~1033, 2005.

12.  Cooper, IR, White, J, Mahenthiralingam E and Hanlon, GW : Longterm persistence of a single Legionella pneumophila strain possessing the mip gene in a municipal shower despite repeated cycles of chlorination. J Hosp Infect, 70:154~ 159, 2008.

13.  Köhler, R, Fanghänel, J, König, B, Lüneberg, E, Frosch, M and Rahfeld, JU, et al : Biochemical and functional analyses of the mip protein Influence of the N-terminal half and of peptid- ylprolyl isomerase activity on the virulence of Legionella pneumophila. Infect Immun, 71:4389~4397, 2003.

14.  Cianciotto, NP, Eisenstein, BI, Mody, CH and Engleberg, NC : A mutation in the mip gene results in an attenuation of Legionella pneumophila virulence. J Infect Dis, 162:121~126, 1990.

15.  Benson RF and Fields BS : Classification of the genus Legionella. Semin Respir Infect, 13:90~99, 1998.

16.  Hsu, BM, Chen, CH, Wan, MT and Cheng, HW : Legionella prevalence in hot spring recreation areas of Taiwan. Water Res, 40:3267~3273, 2006.

17.  Yamamoto, H, Hashimoto, Y and Ezaki, T : Comparison of detection methods for Legionella species in environmental water by colony isolation, fluorescent antibody staining and polymerase chain reaction. Microbiol Immunol, 37:617~ 622, 1993.

18.  Tenover, FC, Arbeit, RD, Goering, RV, Mickelsen, PA, Murray, BE and Persing, DH, et al : Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 33:2233~2239, 1995.

19.  Park, EH, Kim, MH, Kim, JA, Han, NS, Lee, JH and Min, SG, et al : Molecular typing of Legionella pneumophila isolated in Busan, using PFGE. J Life Sci, 15: 161~168, 2005.

20.  Lm, E, Jo, E and Jm, E : Report of a rotavirus outbreak in an adult nursing home population. J Am Med Dir Assoc, 1:175~179, 1999.

21.  World Health Organization : Lerionella and the prevention of legionellosis. Geneva, 2007.

22.  Whang, KH, Hwang, YO, Kim, EJ, Jung, JH and Cho, NJ : Distribution and serological characteristics of Legionella spp. isolated from cooling tower waters of public establishments in Seoul. Kor J Env Hlth Soc, 25:20~23, 1999.

23.  Kim, KY, Kim, YS, Song, JC, Lee, SJ, Kim, SU and Choi, TY, et al : Comparison of method for identification and the effects on Legionella pneumophila of the cooling towers in Seoul. J Korean Occup Environ, 13:234~252, 2003.

24.  Kim, SH, Kim, MJ, Kee, HY, Kim, TS, Seo, JJ and Kim, ES, et al : Surveillance of Legionella contamination on water supply systems of public utilizing facilities in Gwangju, Korea. J Bacteriol Virol, 40:19~28, 2010.

25.  Kim, JA, Jung, JH, Kim, SJ, Jin, YH, Oh, YH and Han, GY : Molecular epidemiological relationship of the pathogenicity of Legionella spp. isolated from water systems in Seoul. Kor J Microbiol, 45:126~132, 2009.

26.  Garbe, PL, Davis, BJ, Weisfeld, JS, Markowitz, L, Miner, P, Garrity, F, Barbaree, JM and Reingold, AL : Nosocomial Legionnaires’ disease epide- miologic demonstration of cooling towers as a source. JAMA J Am Med. Assoc, 254:521~524, 2001.

27.  Lee, HK, Yang, HS, Hong, SR, Park, MS, Sim, SK, Lee, BC and Park, MY : Molecular typing of Legionella pneu- mophila Korean isolates from 1985 to 2001. The report of National Institute of Health, 38:18~30, 2001.