서울特別市 保健環境硏究院報 第40號	(2004)

Report of S.I.H.E., 40:224~230	(2004)

한약재 중 잔류 이산화황 분석에 관한 연구

강북농수산물검사소 한약재검사팀

박원희․이정미․홍윤정․유인실․최성민․강희곤

Determination of Sulfur Dioxide

in Herbal Medicine

Gangbuk, Herb Medicine Inspection Team

Won-hee Park, Jung-me Lee, Yun-jung Hong,

In-sil Yu, Sung-min Choi and Hee-gon Kang

Abstract

Results of determination of sulfur dioxide in herbal drug materials were compared by 2 methods : the modified Monier-Williams method(MW) and alkali extraction/Ion exclusion chromatography with pulsed amperometry detection(AE/IEC-PAD). The good linear correlation coefficient of 0.9996 by AE/IEC-PAD method was obtained. The average  recovery of added sulfite in 8 kinds of herbal drug materials by AE/IEC-PAD method was 52.7%. The highest recovery was Dioscoreae Rhizoma(83.2%) and the lowest was Cimicifugae Rhizoma(21.8%). But Paeoniae Radix was never recovered at 5 ppm level of sulfite. Contents of sulfite by MW methods and AE/IEC-PAD method in the 20 kinds herbal drug materials were ranged 75～2458 ppm, ND～590 ppm respectively. Sulfite contents in herbal drugs from the 8 kinds of materials were detected by AE/IEC-PAD method. They were Platycoti Radix, Cirsii Radix, Pinelliae Tuber, Pulsatillae Radix, Cimicifugae Rhizoma, Achyranthis Radix, Gentiana Macrophyllae Radix and Astragali Radix. The others (12 kinds) were not detected. The sulfite contents in herbal drug materials extracted with the pH 9 buffer were generally higher than those obtained at pH 6.

Key words : sulfite, herbal medicine, ion exclusion chromatography

서  론

식품과 음료 중에 있는 아황산(sulfite)의 정량은 1986년 미국 식품의약품안전청(U.S. FDA)에서 10 ppm 이상의 SO2를 함유하고 있는 식품에 대해 표시할 것을 요구하기 시작한 이후, 식품제조업자들에게 관심의 대상이 되어왔다.

현재까지 아황산의 측정법으로는 여러 가지 방법이 보고되어 있으며, AOAC International에서는 여러 측정방법을 채택하고 있는데 1892년 고기 중에 sulfurous acid(free)를 titrimetry로 정량한 방법(1)을 시작으로 많은 분석법을 소개하였으며 이들은 Differential Pulse Polarography, Optimized Monier-Williams Method, Flow Injection Analysis, Ion Exclusion Chromato- graphy 등(2~7)이다. 식품 중에 아황산 정량의 표준 방법으로서 Monier-Williams법을 사용하고 있으며 이는 산 증류 및 적정방법이다. 이 방법은 장시간 (1.75시간)의 강산에 의한 증류로 분석시간이 길며 10 ppm 농도이하에서는 검출하기 어려운 단점 등이 있다. 또한 휘발성산, 예로 acetic acid나 butyric acid 등을 함유하거나 sulfides와 같은 유기유황화합물이 들어있는 경우에는 false positive reaction이 일어나기 떄문에 검출량의 오류를 범하고 있다(2). 한편 1995년 AOAC International에서는 아황산을 정량하기 위한 크로마토그래픽 방법을 채택하였는데 이 방법은 1986년 김과 김(8)에 의해서 처음으로 발표되었다. 이 방법은 direct current(dc) amperometric detection에 의한 Ion Exclusion Chromato- graphy로서 Monier-Williams법에 비해 감도가 매우 높을 뿐 아니라 사용하기 쉬운 여러 장점들을 가지고 있다. 그러나 크로마토그래픽 방법에 있어서 하나의 단점은 아황산을 산화시켜 검출하게 되는데 이때 사용되는 Pt작용전극이 단시간에 오염(fouling)된다는 것이다. 전극의 오염으로 인해 시간이 지남에 따라 아황산이 검출기 반응에 상당한 감소를 가져오며 이는 정확한 정량을 하는데 있어 매우 심각한 문제가 된다. 이러한 문제는 시료와 표준물질을 번갈아 주입해 주고, 작용전극을 주기적으로 세척해 줌으로서 어느 정도 해결할 수 있다.

위에서 언급한 전극오염의 문제를 해결하기 위해서 Pulsed amperometric detection (PAD)방법이 개발되었는데(9) PAD방법은 탄수화물을 분석하는데 주로 사용되었으며 이를 이용한 식품 및 음료에서의 아황산 분석 등이 보고되어 있다(10~ 11).

한편 건강에 대한 국민들의 관심이 고조되면서 질적으로 건강한 삶을 영위하고자 하는 욕구가 나날이 증가하고 있다. 근래에는 한방치료가 늘어나면서 한약재의 소비도 증가되고 있다. 따라서 인공적인 재배방법 및 다량 수입을 통해 한약재가 유통되고 있는 실정이다. 특히 수입한약재의 80- 90%를 차지하는 중국산은 현지의 고온다습한 기후로 연탄훈증 및 유황훈증에 의해 가공된 한약재에서 표백제성분인 아황산염이 검출되어 문제시 되고 있다. 우리나라 식품의약품안전청에서는 1998년 『수입의약품등관리규정』중 표백제 검사를 신설한 이후 2004년에 입안예고된 생약 중 잔류이산화황시험법은 그 시험방법이 모니어-윌리엄스 변법이다. 아황산염류 측정법으로 AOAC에서 공인된 방법은 주로 식품이나 음료를 대상으로 한 예가 많으나 한약재를 크로마토그래픽 방법으로 정량한 경우는 미미하다. 따라서 시중 유통 중인 한약재 20여종의 잔류이산화황 함유량을 모니어-윌리엄스 변법 및 크로마토그래픽 방법으로 비교해보며 PAD에 의한 Ion Exclusion Chromato- graphy를 한약재에 적용 가능한지 알아보고자 본 연구를 수행하였다.

재료 및 방법

1. 재료

2004년 하반기에 서울 시내 경동약령시장에서 판매되는 국산 및 수입산 한약재 검인(芡仁), 계피(桂皮), 길경(桔梗), 대계근(大薊根), 반하(半夏),백두옹(白頭翁), 산약(山藥), 승마(升麻), 용안육(龍眼肉), 우슬(牛膝), 인삼(人蔘), 작약(芍藥), 조구등(釣鉤藤), 지실(枳實), 진범(秦汎), 천궁(川芎), 천화분(天花)粉), 초오(草烏), 팔각회향(八角茴香), 황기(黃芪), 등 20종을 대상으로 하였으며 분쇄기로 갈아 가루로 한 후 실험에 사용하였다.

2. 시약 및 장치

1) 모니어-윌리암스변법

hydrogen peroxide(30%), hydrochloric acid, ethanol, methyl red 시약은 모두 특급을 사용하였으며, 0.01 N-sodium hydroxide, 0.1 N-sodium hydroxide 표준액은 용량분석용 시약을 사용하였다.

장치는 식품공전의 일반시험법 중 아황산, 차아황산 및 그 염류의 정량시험법인 모니어-윌리암스변법에 나오는 것을 제작하여 사용하였다.

2) Ion Exclusion Chromatography

Sodium sulfite anhydrous, Sodium phosphate dibasic heptahydrate 및 D-mannitol 은 Sigma Chemical Co.를 사용하였고 Concentrated  sulfuric acid 은 ACS Reagent Grade를 그리고 증류수는 Water purifier(Elga Co.)를 통과한 초순수를 사용하였다.

Table 1. Experimental conditions of IC for the determination of sulfite

Column:	Ion Pac® ICE-AS1
Eluent:	20 mN H2SO4
Flow Rate:	1.0 ㎖/min
Inj.Vol.:	50 ㎕
Detection:	Pulsed amperometry, Pt electrode;
Waveform:	Time(s)	Voltage(V)	Integration
	0.00	0.80
	0.40	0.80	begin
	0.60	0.80	end
	0.61	1.20
	0.70	1.20
	0.71	0.10
	1.00	0.10
Pump	GP40
Autosampler	Spectrasystem AS3500
Detector	ED40

이온크로마토그래프법은 DX-500 System (Dionex)을 사용하였으며 분석조건은 표 1에 명시되어 있다.

3. 검량선 작성

Sodium sulfite anhydrous를 이산화황으로서 농도가 10, 20, 30, 40, 50 ㎍/㎖이 되도록 알칼리 추출 buffer로 조제해서 IC법에 의하여 피크 높이비를 구하여 검량선을 작성하였다.

4. 회수율 시험

Sodium sulfite anhydrous를 이산화황으로서 500 ppm농도로 만든 후 1 ml를 분쇄한 검체 1 g에  alkali buffer로 100 ml 희석 후 한약재 8종의 회수율을 각각 측정하였다.

5. 실험방법

1) 모니어-윌리암스 변법

식품공전 제7. 일반시험법 19 아황산, 차아황산 및 그 염류시험법 2)정량시험(1) 모니어-윌리암스 변법에 따라 실험하였다.

2) 이온크로마토그래프법

(1) 시약 조제

① 이동상

20 mN 황산은 0.55 ml 농축 황산을 탈이온수로 1.0 L까지 희석하여 제조하였다.

② 추출 buffer (pH 9 및 pH 6)

5.36 g sodium phosphate dibasic hepta -hydrate와 1.82 g D-mannitol을 무게를 달아 증류수로 1.0 L까지 희석하였으며 최종 액성은  pH meter로  pH 9 및 6으로 조정하여 검체 추출 시 사용하였다.

(2) 검액의 조제

분쇄한 한약재는 무게를 달아 phosphate- mannitol buffer로 일정량 희석하여 10분간 ultrasonication 하여 C18 Sep-pak cartridge로 처리한 후 0.45 ㎛ syringe filter로 다시 여과 후 사용하였다.

결과 및 고찰

1. 검량선 작성 및 회수율 측정 결과

Sodium sulfite anhydrous를 phosphate- mannitol buffer로 희석하여 이를 이산화황으로 환산했을 떄  1, 2, 3, 4, 5 ㎍/㎖가 되도록 조제한 후 이온크로마토그래프법에 따라 실험하였고 sulfite 표준액에 대한 검량선을 작성한 결과를 그림 1에 나타내었다. Sulfite의 R2는 0.9996으로서 양호한 직선성을 나타내었으며 0.07 ㎍/㎖의 저농도에서도 검출이 가능하였다. 한편 회수율시험은 모니어-윌리암스 변법 및 이온크로마토그래프법에서 이산화황이 불검출된 한약재 8종을 선택하였으며, Sulfite 표준액을 spiking하여 이산화황의 최종농도가 5 ㎍/㎖이 되도록 추출한 후 회수율을 측정하여 그 결과를 표 2에 나타냈다.

회수율이 가장 높은 시료는 산약, 반하로 각각 83.2%, 76.0%이며 승마는 21.8%로서 가장 낮은 회수율을 보였다. 그러나 작약은 전혀 회수가 되지 않은 것으로 나타났다. 평균 회수율은 52.7%로서 나타났다.

Table 2. Recoveries of SO2 added several herbal medicines by ion exclusion chromatography(PAD) methods

Samples	SO2 Added (ppm)	SO2 Founded (ppm)	Recovery (%)
Achyranthis Radix	5	2.43	48.6
Astragali Radix	5	3.30	66.0
Cimicifugae Rhizoma	5	1.09	21.8
Dioscoreae Rhizoma	5	4.16	83.2
Ginseng Radix alba	5	3.14	62.8
Paeoniae Radix	5	ND	ND
Pinelliae Tuber	5	3.80	76.0
Platycoti Radix	5	3.17	63.4

* ND : not detected

Fig. 1. Calibration curve for sulfite.

강 등의 연구(12)에 의하면 작약은 연탄 건조시 모니어-윌리암스 변법이 407.3 ppm이었으나 알칼리추출/이온크로마토그래프법에서는 검출되지 않은 것으로 보고하였는데 이는 작약의 회수율이 검출되지 않는 결과와 일치한다. 따라서 작약에는 이산화황 분석을 방해하거나 흡착하는 성분이 있는 것으로 생각되어 진다.

2. 한약재중의 이산화황 함량 측정결과

1) 모니어-윌리암스 변법 및 이온크로마토그래프법에 따른 이산화황 함유량 비교 검토

모니어-윌리암스 변법 및 알카리추출/이온배제크로마토그래프법의 시료는 시중 유통 중인 한약재 20여종을 선택하였으며 이 두가지 방법에 의한 이산화황의 농도는 표 3에 비교하였다.

모니어-윌리암스 변법에 의한 이산화황은  검출 범위가 75-2458 ppm, 이온크로마토그래프법에서는 0-590 ppm의 결과를 나타내었다.

지금까지 알려진 바와 같이 모니어-윌리암스 변법으로 얻은 과산화수소 포집액에 적정법의 결과가 이온크로마토그래프법에 의한 결과보다 대체로 높은 것은 아황산 이외의 휘발성 산성성분에 의한 것으로 추정하고 있다(10). 따라서 이온크로마토그래프법은 sulfite만을 선택적으로 검출하기 때문에 위에서 언급한 적정오차는 줄일 수 있으리라 본다. 또한 아황산은 쉽게 sulfate로 산화되기 때문에 표준액과 검액은 가급적 빠른 전처리를 하였고 추출액은 free and bound sulfite 모두 추출할 수 있으며 mannitol은 sulfite에서 sulfate로의 산화속도를 늦추는 역할을 하는 것으로 알려졌다.

이온크로마토그래프법에 의한 sulfite peak는 9분대에 분리가 가능하였다. 표준액, 검출된 한약재 및 검출되지 않은 한약재 각각의 크로마토그램은 아래 그림 2～4와 같다.

모니어-윌리암스 변법에서 검출되었으나 이온크로마토그래프법에서 검출되지 않은 한약재는 검인, 계피, 산약, 용안육, 인삼, 작약, 조구등, 지실, 천궁, 천화분, 초오, 팔각회향 등 12종으로 검출율은 40%로 나타났다.

Table 3. Comparision of sulfite determined by  Monier-William's modified method and ion chromatography-PAD(As SO2)

Samples	Monier- Williams Methods (ppm)	IC 법 PAD (ppm)
Achyranthis Radix	1,282	590
Aconiti Ciliare Tuber	486	ND
Anisi Stellati Fructus	106	ND
Astragali Radix	1,039	183
Cimicifugae Rhizoma	1,303	275
Cinnamomi Cortex	76	ND
Cirsii Radix	880	153
Cnidi Rhizoma	210	ND
Dioscoreae Rhizoma	125	ND
Euryales Semen	75	ND
Gentianae Macrophyllae Radix	2,458	353
Ginseng Radix alba	37	ND
Longanae Arillus	123	ND
Paeoniae Radix	193	ND
Pinelliae Tuber	386	33
Platycoti Radix	661	303
Ponciri Fructus	220	ND
Pulsatillae Radix	1,503	122
Trichosanthis Radix	126	ND
Uncariae Ramulus et Uncus	998	ND

*ND : not detected

이온크로마토그래프에서 검출된 한약재 8종 중 두 방법의 이산화황 농도 차가 가장 큰 한약재는 반하 및 백두옹이며 길경과 우슬은 농도차가 적은 한약재로 나타났다. 두 방법으로 검출된 이산화황의 평균농도는 모니어-윌리암스 변법이 614 ppm, 알카리추출/이온배제크로마토그래프법이 101 ppm으로 이온크로마토그래프법이 평균적으로 볼 떄 16%의 낮은 검출양을 보였다. 이온크로마토그래프법은 전처리과정이 알칼리 직접추출이므로 분석시간이 짧고 전처리가 간단하며 선택성이 큰 방법으로 액상 시료의 예로서 주스나 와인 등의 제품에서는 쉽게 적용할 수 있는 장점이 있으나 한약재의 경우는 알칼리 Buffer로 직접 추출하여 일괄 적용하기에는 어려움이 크리라 생각된다.

Fig. 2. IC Chromatogram of sulfite standard solution(as SO2).

Fig. 3. IC Chromatogram of Achyranthis Radix

(sulfite detected).

Fig. 4. IC Chromatogram of Ginseng Radix alba(sulfite not detected).

2) 추출액의 액성에 따른 비교

추출액의 액성에 따른 이산화황 농도를 비교 하고자 phosphate-mannitol buffer를 pH 9 및 pH 6으로 조제한 후 각각의 buffer로 백두옹 등 8종 한약재를 추출했을 때 이산화황 농도는 표 4와 같다.

대부분의 한약재가 pH 6 buffer보다는 pH 9 buffer로 추출했을 떄 이산화황 검출농도가 전반적으로 높은 것으로 나타났다. 두 pH간의 농도차가 큰 한약재는 우슬 및 길경, 진교 등으로 100～150 ppm의 차이를 보였고  단지 백두옹은 pH 6 buffer에서 이산화황 농도가 높은 것으로 나타났으나 그 차이는 28 ppm으로 나타났다.

한편 백두옹 및 승마는 pH 9 buffer로 추출 시 시간에 따른 경시변화가 상당히 커서 이산화황의 농도가 급속히 떨어지는 경향을 보여 가급적 전처리시간을 10분으로 일정하게 적용시켰다. 그러나 pH 6 buffer에서의 시간에 따른 경시변화는 나타나지 않았다.

모니어-윌리암스 변법을 적용할 떄 생기는 분석오차를 알칼리 직접추출에 의한 이온크로마토그래프법으로 적용하면 sulfite만을 선택적으로 분석할 수 있고 분석시간이 단축되며 저농도에서도 검출이 가능한 여러 장점을 가지고 있다.

Table 4. Comparison of sulfite in different pH value buffer(As SO2)

Samples	SO2 ppm
	pH 9	pH 6
Achyranthis Radix	590	483
Astragali Radix	183	183
Cimicifugae Rhizoma	275	250
Cirsii Radiix	153	100
Gentianae Macrophyllae Radix	353	223
Pinelliae Tuber	33	28
Platycoti Radix	303	145
Pulsatillae Radix	122	150

그러나 한약재는 시료마다 지닌 성분이 너무 다양하고 내부 조직의 구조 및  각각의 특성이  있으므로 이중 잔류하는 이산화황과의 화학적 상관관계를 밝히는 것이 중요하리라 생각된다.

따라서 모든 한약재에 일괄 적용하여 분석하기에는 많은 보완이 이루어 져야 할 것으로 생각된다.

결  론

서울 약령시장에서 유통 중인 한약재 검인, 계피, 길경, 대계근, 반하, 백두옹, 산약, 승마, 용안육, 우슬, 인삼, 작약, 조구등, 지실, 진범, 천궁, 천화분, 초오, 팔각회향, 황기 등 20종에 대하여  한약재 중 잔류이산화황의 함량을 모니어-윌리암스 변법 및 알칼리추출/이온배제크로마토그래프법으로 각각 적용하여 분석한 후 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 이온크로마토그래프법에 의한 Sodium sulfite anhydrous 표준액 검량선을 측정한 결과 상관계수(r2)는 0.9996으로 양호한 편이였으며, 8종 한약재에 5 ppm 농도로 spiking 한 경우의 회수율은 산약(83.2%) 및 반하(76.0%)가 가장 높았으며 승마는 21.8%로 가장 낮은 결과가 나왔고 작약은 전혀 회수가 되지 않았다. 평균회수율은 52.7%이다.

2. 20종 한약재를 대상으로 모니어-윌리암스 변법 및 알칼리추출/이온배제크로마토그래프법으로 이산화황 함류량을 비교해 보면 모니어-윌리암스변법의 검출범위는 75～2,458 ppm(평균 614 ppm), 이온배제크로마토그래프법은 0～590 ppm(평균 101 ppm)으로 검출되었고 검인, 계피, 산약, 용안육, 인삼, 작약, 조구등, 지실, 천궁, 천화분, 초오, 팔각회향 등 12종은 모니어-윌리암스 변법에서는 검출되었으나 이온배제크로마토그래프법에서 검출이 안되었으며 이온배제크로마토그래프법의 검츌율은 40%로 나타났다.

3. 추출액의 액성에 따른 이산화황 함량을 비교해 보고자 8종의 한약재를 pH 9 및 pH 6의 2가지 buffer로 분석한 결과 pH 9 buffer가 전반적으로 높은 농도로 나타났다.

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