서울特別市 保健環境硏究院報 第41號	(2005)

Report of S.I.H.E., 41:192～199   (2005)

HPLC를 이용한 생약제제 중 Cinnamic Acid의 추출과 정량

약품화학팀

박양순․김화순․이정숙․고숙경․최부철․안지숙․김진곤․조남준

Extraction and Analysis of Cinnamic Acid in Medicinal Preparations by High Performance Liquid Chromatography

Pharmaceutical Chemistry Team

Yang-soon Park, Hwa-soon Kim, Jeong-sook Lee, Suk-kyung Ko

Bu-chuhl Choe, Ji-sook Ahn, Jin-gon Kim and Nam-joon Chough

Abstract

A high-performance liquid chromatographic method of the determination of cinna-mic acid in medicinal preparations which contains Cinnamomi ramulus, Cinnamomi cortex and Cinnamon bark was established. The samples were separated by a μ-Bondapak C18 column with methanol-water-acetic acid(33:66:1) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ㎖/min and determined by UV detection at 280 ㎚. The linear ranges of cinnamic acid was 0.1~100.0 ㎍/㎖(r=0.9999). The recovery rate of cinnamic acid was 88.3~98.5%. The reflux extraction method with methanol as the solvent was definitely superior to the other extraction methods. The method was eligible for determination of cinnamic acid in medicinal preparations which contains cinnamons.

Key words : cinnamic acid, medicinal preparations, cinnamons, HPLC

서  론

녹나무과(Lauraceae)에 속하는 계피(Cinnamon bark)는 계피나무(Cinnamomum cassia Blume) 또는 그 밖의 동속 근연식물의 수피를 그대로 또는 주피를 다소 제거한 것이다. 계지(Cinnamomi ramulus)는 C. cassia Blume의 지름 0.5～1 ㎝ 정도의 작은 가지로서 계피와 같은 용도로 쓰인다(1). 그 효능은 방향성 건위, 구풍, 수렴약 등으로 쓰이며 또 그 가루가 산제, 환제의 부향료로 쓰인다. 한방에선 발한, 해열, 진통, 건위, 정장 등에 쓰이는 등 그 사용예가 많고 사용범위가 넓다. 그 주성분은 정유로서 cinnamaldehyde를 80～90% 정도 함유하고 있으며 cinnamyl acetate, cinnamic acid 등이다(2). 육계(Cinnamomi cortex spissus)는 계피나무의 수간피로 계지, 계피와 그 효능이 비슷하나 한방에서는 계지가 발한해표약(發汗海表藥)으로 육계가 온리약(溫裏藥)으로 사용된다(3).

이들 생약들은 산지와 품종이 다양하여 그에 따른 외형이나 성분 함량의 차이가 있으며 나라마다 공정 생약으로 기원 식물이 다른 경우도 있다(1). 특히 그 성분 중 신남산은 이들 생약을 정량하는데 이용되는 지표물질로서 연구되고 있으며 또한 그 추출방법과 분석방법에 대한 연구도 수행되어 왔다(4～8).

이러한 계피류 생약들은 예로부터 온경탕(溫經湯), 갈근탕(葛根湯), 계지탕(桂枝湯), 계지복령환(桂枝茯笭丸), 오령산(五苓散), 소건중탕(小建中湯), 영계출감탕(苓桂朮甘湯), 소청룡탕(小靑龍湯), 안중산(安中散), 계지가갈근탕(桂枝加葛根湯) 등 많은 한방처방에 사용되며(1) 현재까지도 폭넓게 사용되고 있고 탕제는 물론 이를 제제화하여 손쉽게 복용할 수 있게 되었다. 이에 따라  이들 생약 제제에 대한 추출 및 분석법에 대한 연구가 요구되어 지고 있다. 대부분의 생약제제는 여러 다른 생약들을 포함하는 복합제제로서 단일 생약을 추출하고 분석하는 실험과는 다른 차원의 연구가 필요하다. 계피류 생약을  포함한 생약 제제와 탕제의 추출 및 분석법 연구는 국내(9)는 물론 일본(10)과 중국(11), 대만(12)에서도 연구된 바 있다. 그러나 그 수가 적고, 기기분석방법에 대한 연구가 대부분이어서 추출방법에 대한 연구는 미약하다.

현재 국내에서 계피, 계지, 육계를 처방으로 하여 제조되는 생약제제 중 함유된 신남산의 정량을 식품의약품안전청고시 의약품 등 기준 및 시험방법 제 2개정 일반시험법 중 생약시험법의 함량시험법(13)에 따라 시험하도록 품질관리 시험방법이 정해져있으나 실제 그 시험법이 여러 다른 생약들의 추출물과 섞여있는 복합제제의 경우에 신남산을 유효하게 추출하고 정량할 수 있는 지에 대한 유효성 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 실험은 신남산을 함유한 복합생약제제 중 신남산을 추출, 정량하는 최적의 조건을 찾고자 수행되었다.

재료 및 방법

1. 실험재료

시중 유통되는 생약제제 중 계피, 계지, 육계를 함유하는 6종의 제품을 구입하여 실험에 사용하였다. 그 제형별로는 소환이 2종, 대환이 2종, 과립제가 2종이었으며, 신남산에 대한 각 제제의 표시량 및 기타 원료로 배합된 생약들의 구성은 표 1과 같다.

2. 시약

표준물질은 Wako(Japan)사의 trans-cinnamic acid를 사용하였고, 추출용매로 사용된 메탄올, 에테르는 특급시약을 사용하였다.

3. 장비와 기기

속실렛 추출시 수욕조와 추출장치는 각각 Lauda (Germany)사의 제품과 Pyrex(USA)사 제품을 사용하였다. 환류 추출시의 수욕조는 한미하이테크(주)(한국)사 제품을 사용하였고 초음파추출을 위해 Branson(USA)사 8510 model의 초음파추출기를 사용하였다. 액체크로마토그라프는 검출기로서 DAD(Diode Array Detector)를 갖춘 Agilent(USA)사의 1100series를 사용하였고 분석조건은 표 2와 같다.

4. 실험방법

1) 표준액의 조제

신남산 표준물질 10 ㎎을 정밀하게 취하여 100 ㎖ 용량플라스크에 넣고 메탄올에 녹여 눈금을 맞추어 표준원액으로 하였다.

표준원액을 0.1, 1.0, 10.0, 50.0, 100.0 ㎍/㎖가 되도록 메탄올로 희석하여 검량선을 작성하였다.

Table 1. Composition of tested samples
Sample No.	Composition		Dosage forms
	Target component	Other components
1	Cinnamon bark (cinnamic acid 0.9㎍/phill)	Steamed Rehmannia Root Cornus Fruit Dioscorea Rhizome Alisma Rhizome Hoelen Moutan Root Bark Prepared Aconite	pills (small)
2	Cinnamomi cortex spissus (cinnamic acid 3.3㎍/phill)	Steamed Rehmannia Root Cornus Fruit Dioscorea Rhizome Alisma Rhizome Hoelen Moutan Root Bark Schisandra Fruit	pills (small)
3	Cinnamon bark (cinnamic acid 120㎍/dose)	Pueraia Root Ephedra Herb Jujube Peony Root Glycyrrhiza Root Ginger	granules
4	Cinnamomi ramulus (cinnamic acid 80㎍/dose)	Ephedra Herb Peony Root Ginger Asiasarum Root Schisandra Fruit Pinellia Tuber Glycyrrhiza Root	granules
5	Cinnamon bark (cinnamic acid 30㎍/phill)	Hawthorn Fruit Glycyrrhiza Root Piperis Longi Fructus Clove Cyperus Rhizome Alpiniae Rhizome Atractylodes Rhizome White Hoelen	pills (large)
6	Cinnamomi cortex spissus (cinnamic acid 49.95㎍/phill)	Steamed Rehmannia Root Cornus Fruit Dioscorea Rhizome Alisma Rhizome Hoelen Moutan Root Bark Prepared Aconite	pills (large)

2) 검액의 조제

실험에 사용된 생약제제는 다음 세 가지 방법에 따라 신남산을 추출하였다.

각 생약제제의 품목허가증 상에 기준 및 시험방법으로 등재되어있는 식품의약품안전청고시 생약시험법 중 계지, 계피, 육계의 함량시험법(13)인 soxhlet추출법으로 실험하였고, 박 등(4)이 계지, 계피, 육계 등 원 생약으로 신남산의 추출률을 비교한 실험 중 추출률이 높고 비교적 실험조작이 간편한 메탄올 환류 추출법과 메탄올 초음파 추출법을 사용하였다.

검체의 제형별로 소환과 과립제는 분쇄기로 갈아 가루로 한 후 실험에 사용하였고 대환은 제제의 특성상 수분이 많아 가루로 하기 어려우므로 수분을 제거하기 위해 잘게 잘라 60℃ 건조기에서 4시간 건조하고 데시케이터에서 방냉한 후 가루로 하였다. 이 때 발생한 건조감량은 함량 계산 시에 산입하였다.

속실렛 추출은 가루로 한 검체 10.0 g을 정밀히 달아 원통형 여지에 넣고 250 ㎖ 둥근바닥플라스크에 에테르 100 ㎖를 넣고 55℃의 수욕상에서 속실렛 추출기와 냉각관을 연결하여 4시간동안 추출한 후 에테르층을 감압 건조하여 메탄올 50 ㎖로 정용하여 검액으로 하였다. 메탄올 환류추출은 검체 10.0 g을 정밀하게 달아 250 ㎖ 둥근바닥플라스크에 취하여 메탄올을 90 ㎖를 넣고 4시간 동안 추출한 다음 100 ㎖ 용량플라스크에 여과하여 메탄올로 눈금을 맞추었다. 메탄올 초음파 추출은 검체 10.0 g을 정밀하게 달아 100 ㎖ 용량플라스크에 취해 메탄올 90 ㎖를 넣고 실온에서 30분간 초음파 한 후 여과하여 100 ㎖로 정용한 후 검액으로 하였다.

3) 회수율 측정

각각의 추출방법과 동일하게 무게를 단 표 1의 1번 검체에 신남산 10.0 ㎍/㎖의 양이 되도록 표준원액을 첨가한 후 검액의 조제와 같은 과정으로 추출하여 회수율을 측정하였다.

4) HPLC에 의한 분석

표준액과 각각의 추출된 검액을 표 2의 조건으로 신남산을 분석하였고 그 함량을 비교 검토하였다.

Table 2. Analytical condition of HPLC
Column	μ-Bondapak C18 (3.9 ㎜ × 300 ㎜)
Detector	Diode array detector(280 ㎚)
Flow rate	1.0 ㎖/min.
Column temp.	Room temp.
Mobile phase(%)	Methanol：Water：Acetic acid (33：66：1)
Injection volume	10 ㎕

결과 및 고찰

1. 검량선의 작성

신남산을 0.1, 1.0, 10.0, 50.0, 100.0 ㎍/㎖되도록 조제한 표준액을 HPLC에 주입하여 얻은 검량선은 그림 1과 같다. 0.1 ㎍/㎖에서 100.0 ㎍/㎖의 농도범위에서 얻어진 검량선의 r값은 0.9999로서 양호한 직선성을 나타내었다.

Fig. 1. Calibration curve of cinnamic acid.

2. 회수율 측정

각 추출법에 대한 신남산의 회수율은 표 3과 같다. 속실렛 추출의 경우 93.9%의 회수율을 보였고 메탄올을 추출용매로 한 초음파 추출의 회수율은 98.5%, 메탄올로 환류추출한 방법의 회수율은 88.3%을 각각 보여 비교적 양호한 회수율을 보였다.

Table 3. Recovery rate of cinnamic acid in sam-ple 1 according to the extrac-tion methods
	Recovery rate(%)
Soxhlet extraction	93.9
Ultrasonic extraction	98.5
Reflux extraction	88.3

3. 신남산의 분리

표 2의 조건으로 HPLC에 신남산의 표준액과 검액을 주입했을 때 얻은 크로마토그램은 그림 2와 같다. Wen 등(12)은 생약제제 중 신남산을 분리․정량하였는데 약 4분대에서 신남산의 피크를 용리시켰으나 다른 성분들의 피크에 의한 방해로 신남산만의 피크로 분리되기 어려웠으므로 본 실험에서는 피크유지시간을 약 30분대로 하여 다른 성분들의 방해없이 잘 분리되는 것을 볼 수 있었다.

Fig. 2. Chromatograms of standard solution and sample solutions by various extraction methods.

검체 1의 검액을 주입했을 때의 크로마토그램을 추출방법별로 비교하여 보면 속실렛 추출방법의 크로마토그램은 신남산 이외의 피크가 적고 baseline이 안정적이나 그 피크의 크기가 초음파 추출과 환류 추출에 비하여 작다. 초음파 추출과 환류추출은 신남산 외의 다른 성분의 피크들이 속실렛 추출법에 비해 많고 크나 비교적 분리가 잘 되고 신남산 피크가 속실렛 추출에 비해 커진 것을 볼 수 있었다.

검체 1의 추출방법별 검액에서 검출된 신남산의 스펙트럼을 표준액의 스펙트럼과 비교하여 보면 그림 3에서와 같이 약 280 nm에서 모두 흡수극대를 나타내고 검액과 표준액이 동일한 패턴의 자외부흡광스펙트럼을 보여주었다.

Fig.  3.  UV spectrums of cinnamic acid in standard solution and sample solutions by various extraction methods.

4. 생약제제 별 추출방법에 따른 신남산의 추출효율과 함량

표 4는 각 생약제제를 에테르로 속실렛 추출한 방법과 메탄올을 용매로 초음파 추출한 방법 그리고 메탄올로 환류 추출한 방법에 대하여 신남산의 함량을 제제 1 g중 함유된 신남산의 ㎍값과 표시량에 대한 함량값(%)으로 나타내었다.

속실렛 추출법으로 실험한 결과 검체 6개의 신남산 함량은 2.3～14.2 ㎍/g인데 비하여 메탄올로 초음파 추출한 결과 9.8～131.0 ㎍/g의 신남산이 추출되었다. 또한 메탄올로 환류추출한 경우 10.9～208.5 ㎍/g의 결과를 나타내어 가장 높은 추출효율을 보여주었다. 이를 표시량에 대한 함량(%)으로 환산하여 보면 속실렛 추출은 5.9～161.5%, 메탄올 초음파추출 82.3～443.3%, 메탄올 환류추출은 120.2～943.4%의 함량을 나타내었다.

이 결과로 메탄올을 추출용매로 환류추출을 하였을 때 신남산이 가장 잘 추출됨을 알 수 있었으며, 메탄올 초음파 추출, 에테르 속실렛 추출 순으로 추출율이 낮아지는 것을 볼 수 있었다. 이것은 박 등(4)의 연구결과에서 보여준 계피류 생약에 대한 추출방법에 따른 추출율과 비슷한 결과였다.

속실렛 추출방법은 유독한 에테르를 추출용매로 사용하면서 번거로운 추출장치를 이용하여 추출한 다음 감압건조하고 다시 메탄올로 정용함으로서 실험자의 유독한 작업환경, 조작의 번거로움, 전처리가 장시간 걸리는 단점이 있고 추출효율이 상당히 낮다. 반면 메탄올 초음파 추출은 세가지 방법 중 가장 간편하면서도 초음파로 추출하고 여과하여 정용하는데 걸리는 시간이 속실렛 추출에 비하여 상당히 단축된다. 또한 메탄올을 용매로 환류 추출을 할 경우도 속실렛 추출에 비해 추출처리조작이 간단하며 추출효율은 가장 높아 추출방법으로는 가장 효과적인 것으로 나타났다.

본 연구 결과 제품의 품질관리 방법으로 속실렛 추출방법을 계속해서 사용할 경우 실제 제품에는 표시량보다 많은 양의 계피류 생약이 제품에 배합되어 인체에 복용되는 양이 적정량을 넘어설 수 있으나 품질관리결과에는 아무 이상이 없거나 오히려 기준에 부적합한 것으로 오인될 수 있어 문제를

Table 4. Comparison of the extraction efficiency of cinnamic acid in samples according to the extraction methods
Sample No.	Soxhlet extraction			Ultrasonic extraction			Reflux extraction
	amount (㎍/g)	percentage for labeled amount(%)		amount (㎍/g)	percentage for labeled amount(%)		amount (㎍/g)	percentage for labeled amount(%)
1	10.3	161.5		27.0	424.6		60.0	943.4
2	5.0	22.5		18.1	82.3		26.0	120.2
3	2.3	5.9		131.0	337.3		208.5	537.0
4	14.2	74.0		46.8	244.6		79.9	417.3
5	7.8	53.0		65.0	443.3		70.3	479.4
6	3.8	68.4		9.8	176.8		10.9	198.8

야기 시킬 가능성이 크다고 보여 진다.

본 연구에서 계피류 생약을 함유한 6종의 시판되는 복합생약제제에 대하여 신남산의 추출방법과 분석법을 검토한 바 그 방법이 유효한 것으로 여겨지나 여기서 다루어지지 않은 다른 제제에 대해서는 각 제제의 특성에 적합한 추출과 분석방법이 개별적으로 더 연구되어져야 할 것으로 사료된다.

결  론

시중 유통 중인 계피류 생약함유 제제 6종에 대하여 계피류 생약의 지표물질인 신남산을 추출하여 HPLC로 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1% 초산이 함유된 33% 메탄올을 이동상으로 하고 역상컬럼을 사용하여 복합생약제제 중의 신남산을 HPLC로 분석한 결과 검량선의 직선성이 0.1～100.0 ㎍/㎖의 농도에서 0.9999의 값을 보이며 크로마토크램 상에 다른 성분들과의 분리능이 좋게 분석되었다.

생약제제 중의 신남산을 세가지 방법으로 추출한 결과 식품의약품안전청 고시에 준하여 실험한 속실렛 추출법에 비하여 메탄올로 30분 초음파 추출한 방법과 메탄올로 4시간 환류추출한 방법이 더욱 좋은 추출효율을 나타내었다.

각각의 추출방법에 대한 회수율은 속실렛 추출법 93.9%, 초음파 추출법 98.5%, 환류추출법에서 88.3%로서 비교적 양호한 값을 나타내었다.

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