서울特別市 保健環境硏究院報 第41號	(2005)

Report of S.I.H.E., 41:284～294	(2005)

환자에서 분리된 Shigella flexneri의 항생제 내성과 병원성 유전자에 대한 연구

역학조사팀

승현정․한창호․지형선․진영희․김무상․이집호․정윤태․최병현

Antibiotic Resistance and Genetic Analysis of Shigella flexneri Isolated from Patients in Seoul

Epidemiology Team

Hyun-jeung Seung, Chang-ho Han, Hyoung-sun Ji, Young-hee Jin, Moo-sang Kim, Jip-ho Lee, Yoon-tae Chung and Byung-hyun Choi

Abstract

A total of 22 strains of Shigella flexneri isolated from patients in Seoul from 2002 and 2005 were analyzed for biochemical features, serotypes, antimicrobial susceptibility, plasmid profile and virulence gene. Among 22 S. flexneri, 9(40.9%) were serotype 2a, 8(36.4%) were 3a, 3(13.6%) were 2b, 1(4.5%) was 4a and 1(4.5%) was 3b. S. flexneri were resistant to streptomycin(100%), tetracycline(100%) and trimthoprim/sulfa-meth-oxazole(77.3%), but susceptible to amikacin(100%), kanamycin(100%) cefoxitin(100%), gentamicin(100%), ceftriaxone(95.5%), ciprofloxacin(90.9%) and nalidixic acid(86.4%). The most isolates were showed the multiple resistance to more than three antimicrobial agents and the antibiogram could be classified into 4 groups. The isolates were differentiated into 5 groups by plsamid profile(P1, P2, P3, P4 and P5). By PCR, ipaH and ial genes were detected from all strains, but stx gene was not. set1A and set1B genes were detected from 12 strains(54.5%) and sen gene was deceted from 19 strains(86.4%).

Key words  :  Shigella flexneri, virulence gene, plasmid profile, antimicrobial susce-ptibility

서  론

쉬겔라균은 복통, 설사, 발열, 분변에 혈액, 농 또는 점액을 동반하는 식중독 및 전염병균으로 매우 중요하며 세균성 이질의 원인균으로 알려져 있다(1). 쉬겔라균은 전염성이 매우 강하며, 감염량이 매우 적으며, 사람 대 사람 감염경로를 통하여 직접 전염될 수 있으며 매우 위험한 병원균이다(2).

세균성이질은 병원체의 항원 특성에 따라 S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei의 4종류로 구분된다. Shigella균속에 의한 감염질환은 사람에만 감염을 일으키고 주로 사람의 분변에 오염된 식수나 음식물을 매개로 전파되거나 환자의 병원체 보유자와의 직․간접적인 접촉에 의해 전파가 되는 것으로 알려져 있다(3). Shigella균은 장내 병원성 세균들이 죽을 수 있는 위의 강한 산성 조건에서도 살아남아 장에 도달하기 때문에 적은 수 (ID50 10～102)의 세균으로도 감염될 수 있고 가족 내 2차 발병률이 10～40%로 다소 높기 때문에 질병 관리에 어려움이 있다. Shigella균의 임상증상은 경미하거나 증상 없이 지나가기도 하나 고열과 구역질, 때로는 구토, 경련성 복통, 후중기를 동반한 설사가 주요 증상이며 전형적인 경우 대변에 혈액이나 고름이 섞여 나오는 경우도 있다.

세균성 이질은 개발도상국에서는 물론 선진국에서도 아열대지방의 해외여행자에서 설사의 중요한 원인균으로 되어있다(4,5). 이질균의 혈청형 중 S. flexneri와 S. dysenteriae는 개발도상국에서 분리빈도가 높은 반면 S. sonnei는 미국을 비롯한 선진국에서 자주 발생하는 설사의 원인균들이다(6).

이질균과 관련된 여러 가지 병원성 인자들 중에 가장 일반적인 것으로 장관 및 장점막에 정착하여 침입하는 장세포 침습성과 전이증식이다. 이 현상은 120-140 MDa plasmid가 갖고 있는 침습성에 관련하는 유전자(ial)와 염색체와 plasmids에 mul-tiple copies로 존재하는 invasion plasmid 항원 H(ipaH) 유전자에 의해 일어난다(7).

S. dysenteriae에 관련된 다른 병원성 인자로는 세균에서 분비되는 것이 아니라 세포가 용해되는 동안에만 유리되는 Shiga 독소가 있으며, 독소생산성이 명확함에도 불구하고 침습성이나 세포 용해에 반드시 필요한 것이 아니므로 세균성 이질에서 Shiga 독소의 작용기전은 명확하지 않다(8). 그러나 최근 S. flexneri 2a에서 두가지 새로운 장관독(enterotoxin)이 밝혀졌다. 첫째는 Shigella ente-ro--toxin 1(ShET-1)으로 set1 염색체 유전자에 code된 것으로 하나의 A subunit와 여러 개의 B subunit으로 구성되어 있다(9). 두 번째의 장관독소인 Shi-gella enterotoxin 2 (ShET-2)는 sen 유전자에 code되어 있고, 140MDa의 plasmid에 존재하며 침습성과 관련이 있다(10).

우리나라에서 유행된 S. flexneri와 S. sonnei의 발생양상을 보면 1980년대에는 S. flexneri가 S. sonnei보다 많이 발생하였으나 1991년 이후부터 S. flexneri의 발생 보다 S. sonnei의 발생이 증가되었다. 그러나 1998년 이후 S. flexneri의 발생도 현저한 증가를 보이고 있다(11).

본 연구에서는 2002년도부터 2005년도까지 서울시내 환자에서 분리된 Shigella flexneri 22주를 대상으로 항생제 감수성, 혈청학적 실험, plas-mid profile 분석을 실시하였고, S. flexneri의 병원성 인자 유전자로서 최근에 새롭게 밝혀지고 있는 set1A, set1B, sen, ipaH, ial 및 stx유전자에 대한 12종류의 primer를 제작하여 poly-me-rase chain reaction(PCR)법으로 병원성 유전자의 검출을 시도하였다.

재료 및 방법

1. 시험균주

2002년에서 2005년에 서울시에서 집단 혹은 산발적으로 발병한 세균성 이질 환자에서 분리된 S. flexneri 22주를 실험균주로 사용하였으며, 모두 선택 분리 배양을 위해 MacConkey agar(Difco, USA)에 도말 배양하여 lactose 분해능을 확인하였다.

2. 생화학적 성상 검사

MacConkey agar에서 lactose를 분해하지 않고 무색, 투명하게 자란 집락을 Klingler's Iron agar(Difco, USA)에 백금선으로 고층부 바닥까지 천자하고 이어서 사면을 도말한 다음 37℃에서 하룻밤 배양하여 K/A로 확인된 균주를 Trypic soy agar(Difco, USA)에 계대하여 단독집락을 채취하여 멸균된 Demineralized water에 부유시키고 Mc-Farland No. 0.5 탁도로 조정하고 API 20E 킷트(Biomerieux, France)에 접종하여 37℃에서 18～24시간 배양한 후 판독하였다. 이 과정을 통해 β-galactosidase 외 19종에 대한 분리균의 당분해능과 효소활성능, 그리고 기질생산능 등에 대한 생화학적 성상을 검사하였다.

3. 혈청학적 검사

쉬겔라균의 군별 혈청학적 시험은 다음과 같이 하였다. 시험용 쉬겔라균을 Trypic soy agar에 도말한 후 37℃에서 18～24시간 배양한 후 일정한 형태를 지닌 균을 선택하여 슬라이드 응집시험을 실시하였다. 쉬겔라균의 군별 항혈청은 질병관리본부에서 제조한 쉬겔라균 군별 진단 항혈청과 일본의 생연(Denka-Seiken)사의 Shigella O 항혈청을 이용하여 혈청형 확인 시험을 실시하였다.

슬라이드 글라스에 여러 개의 칸을 그리고, 각 칸에 멸균 생리식염수를 한 방울씩 떨어뜨린다. 시험균을 백금루프로 따서, 슬라이드 글라스의 각 칸에 떨어뜨린 생리식염수에 균을 골고루 풀어 균질액을 만든다. 슬라이드 글라스를 앞뒤로 기울여 응집유무를 확인한다. 1분 이내에 일어나는 확실한 응집만을 양성으로 판정하며, 1분 이후에 일어나는 응집이나 약한 응집은 음성으로 판정한다. 시험균과 응집하는 다가 항혈청의 이름이 시험균의 혈청군명이 된다. 다가 항혈청의 하나와 응집을 일으켰을 때, 다가 항혈청을 구성하는 단일 항혈청을 사용하여 위와 동일한 방법으로 슬라이드 응집반응을 한다. S. flexneri균의 혈청형은 그룹형 항혈청을 사용하여 결정한다.

4. 항생제 내성 검사

쉬겔라균의 항생제 감수성 시험은 NCCLS(Na-tio-nal Committee for Clinical Laboratory Standards)의 기준(12)에 따른 디스크 확산법(disc diffusion method)을 이용하여 실시하였다. 항생제 디스크로는 BBL sensi-disc(Becton dickinson, USA)를 사용하여 ampicillin(AM), amikacin(AN), ampicillin/sul-batam(SAM), cephalothin(CF), streptomycin(S), kanamycin(K), ceftriaxone(CRO), cefoxitin(FOX), ci-pro-floxa-cin(CIP), chloramphenicol(C), gen-ta-mi-cin(GM), amoxicillin/clauvulanic acid(AmC), nali-dixic acid(NA), tetracycline(Te), ticarcillin(TIC), trimehtoprim/sulfamethoxazole(SXT)의 16종의 항생제에 대한 내성을 검사하였다. Trypic soy agar에서 자란 4～5개의 집락을 Mueller hinton broth (Difco, USA)에 부유시키고 McFarland No. 0.5가 되도록 조정한 다음 균액을 Mueller hinton agar (Difco, USA)에 도말하고 3～5분간 건조시켰다. 그 후 Disc dispenser(Becton dickinson, USA)를 이용하여 디스크를 옮겨 심고 37℃에서 24시간 배양하여 발육억제대를 측정하였다.

5. Plasmid profile

순수 분리된 시험균주 Shigella flexneri 22주를 Trypic soy broth에 접종하여 37℃에서 18～24시간 배양하여 QIAprep® Spin Miniprep Kit(QIAGEN, USA)을 사용하여 추출하였다. Plasmid DNA의 크기를 측정하기 위한 molecular weight marker로는 phage λ DNA HindⅢ digest(TaKaRa Bio-chemicals, Japan)을 사용하였다. 전기영동은 1% agarose gel에서 수평형 영동장치(Mupid-21, Cosmo Bio Co., Ltd, Japan)를 이용하여 100V, 40분간 실시하였으며, DNA의 단편은 자외선 하에서 ethidium bromide(EtBr)으로 염색한 후 확인하였다.

6. PCR법에 의한 병원성 유전자 검출

순수 분리주를 Trypic soy broth에 접종하여 37℃에서 18～24시간 배양시킨 후 AccuPrep® Genomic DNA Extrction Kit(Bioneer, Korea)를 사용하여 추출하였고, primer는 표 1과 같이 enterotoxin 1(A subunit)의 set1A, enterotoxin 1(B subunit)의 set1B, enterotoxin 2의 sen, invasive plasmid antigen H의 ipaH, invasive associated locus의 ial, shiga 독소의 stx 유전자를 각각 선택하였고, Bioneer에서 구입하여 사용하였다.

추출된 2 ㎕의 template DNA를 AccuPower® PCR PreMix(Bioneer, Korea)를 이용하여 PCR을 시행하였으며 유전자 증폭 반응조건은 T-Gradient Thermocycler(Whatman, Germany)에서 dena-turing 95℃ 50초, annealing 55℃ 1분 30초 및 extension 72℃ 2분을 30회 반복하였으며, 최종 extension은 72℃ 7분간을

Table 1. Sequence of primer pairs for the PCR detection of virulence genes
Gene encoding virulence factor	Primer	Oligonucleotide sequence (5' to 3')	Size of amplified product(bp)	References
set1A	ShET1A-U	TCACGCTACCATCAAAGA	309	13
	ShET1A-L	TATCCCCCTTTGGTGGTA
set1B	ShET1B-U	GTGAACCTGCTGCCGATATC	147	13
	ShET1B-L	ATTTGTGGATAAAAATGACG
sen	ShET2-U	ATGTGCCTGCTATTATTTAT	799	10
	ShET2-L	CATAATAATAAGCGGTCAGC
ipaH	Shig-1	TGGAAAAACTCAGTGCCTCT	423	14
	Shig-2	CCAGTCCGTAAATTCATTCT
ial	ial-U	CTGGATGGTATGGTGAGG	320	7
	ial-L	GGAGGCCAACAATTATTTCC
stx	stx-U	CAGTTAATGTGGTTGCGAAG	895	15,16
	stx-L	CTGCTAATAGTTCTGCGCATC

실시하였다. PCR 반응산물은 3% agarose gel상에서 100V, 25분간 전기영동한 후 ethidium bromide(0.5 ㎍/㎖)로 염색하여 확인하였다.

Table 2. Serological characteristics of Shigella flexneri isolated from patients in Seoul(2002 to 2005)
Species	Years	Serotype	No of isolates(%)	Total
Shigella flexneri	2002	2a	5(83.3)	6
		2b	1(16.7)
	2003	2a	1(20.0)	5
		2b	2(40.0)
		3b	1(20.0)
		4a	1(20.0)
	2004	2a	1(12.5)	8
		3a	7(87.5)
	2005	2a	2(66.7)	3
		3a	1(33.3)

결  과

1. 분리균의 생화학적 성상

분리된 22주의 Shigella flexneri에 대해 당분해능, 효소활성능 및 기질생산성을 검사한 결과, D-glu-cose, D-mannitol에서는 22주 모두 양성반응을 보였으며, D-sorbitol은 8주(36.4%), L-rha-m--nose는 3주(13.6%), indole은 2주(9.1%), L-arabinose는 1주(4.5%)에서 양성반응을 나타내었다.

2. 분리균의 혈청학적 검사

분리된 22주의 균주에 대한 혈청학적 특성은 표 2와 같다. 2a는 9주(40.9%), 3a는 8주(36.4%), 2b는 3주(13.6%)이며, 3b와 4a는 각각 1주(4.5%)씩 분리되었으며 연도별로 유행양상도 다르게 나타났다. 2002년에는 전체 6주 중에 2a가 5주(83.3%), 2b가 1주(16.7%)로 2a가 유행의 대다수를 차지하였다. 2003년에는 전체 5주 중에 2b가 2주(40.0%),이고 2a, 3b, 4a가 각각 1주(20.0%)로 유행양상이 다양하였다. 2004년에는 전체 8주 중에서 3a가 7주(87.5%)이고 2a가 1주(12.5%)로 3a가 주로 유행하였으며, 2005년에는 전체 3주 중 2a가 2주(66.7%), 3a가 1주(33.3%)로 분리되었다.

Table 3. Antimicrobial susceptibility of 22 Shigella flexneri isolates from patients in Seoul from 2002 to 2005
Antimicrobial agent	Disc Potency(μg)	No. of isolated(%)
		Resistant	Intermediate	Susceptible
Amikacin	30	0(0)	0(0)	22(100)
Amoxicillin/ Clavulanic acid	20/10	2(9.1)	7(31.8)	13(59.1)
Ampicillin	10	13(59.1)	1(4.5)	8(36.4)
Ampicillin/ Sulbatam	10/10	6(27.3)	4(18.2)	12(54.5)
Cefoxitin	30	0(0)	0(0)	22(100)
Ceftriaxone	30	0(0)	1(4.5)	21(95.5)
Cephalothin	30	1(4.5)	8(36.4)	13(59.1)
Chloramphenicol	30	14(63.6)	6(27.3)	2(9.1)
Ciprofloxacin	5	1(4.5)	1(4.5)	20(90.9)
Gentamicin	10	0(0)	0(0)	22(100)
Kanamycin	30	0(0)	0(0)	22(100)
Nalidixic acid	30	3(13.6)	0(0)	19(86.4)
Streptomycin	10	22(100)	0(0)	0(0)
Tetracycline	30	22(100)	0(0)	0(0)
Ticarcillin	75	14(63.6)	0(0)	8(36.4)
Trimethoprim/ Sulfamethoxazole	1.25/23.75	17(77.3)	0(0)	5(22.7)

3. 항생제 감수성 검사

Table 4. Drug resistance patterns of S. flexneri isolated from patients in Seoul from 2002 to 2005
Years	Multi drug resistance pattern	No of isolates(%)
2002	AM-SAM-S-C-Te-TIC-SXT	5(83.3)
2003	AM-S-C-Te-TIC-SXT	4(80.0)
2004	S-Te-SXT	5(62.5)
2005	AM-S-C-Te-TIC-SXT	2(66.7)

Shigella flexneri 22주에 대하여 amikacin외 15종의 항생제 감수성 검사를 실시한 결과는 표 3와 같았다. Streptomycin과 tetracy-cline은 22주(100 %) 모두 내성을 나타냈으며, tri-metho-prim /sulfa-meth-o-xazole에서는 17주(%), ti--car--cil-lin과 chloram-phenicol에서 각각 14주(63.6 %), ampi-cil-lin에서는 13주(59.1 %)로 내성을 나타냈다. Ami-kacin, kana-mycin, ce-foxi-tin, gentamicin에서는 22주(100 %) 모두 감수성을 나타냈으며, ceftriaxone에서는 21주(95.5 %), ciproflaxacin에서는 20주(90.9 %), nalidixic acid에서는 19주(86.4 %), cephalothin과 amo--xi--cil-lin/cla-vu-la-,nic acid에서는 각각 13주(59.1 %)가 감수성을 나타내었다. 분리주 22주 모두 3가지 이상의 항생제에 대해 다제 내성을 보였으며, 연도별로 보인 다제 내성 양상도 표 4와 같이 다르게 나타났으며, 2002년에는 전체 6주 중 5주가 7가지 약제에 대해 다제 내성을 나타냈으며, 2003년에는 전체 5주 중 4주가 6가지 약제에 대하여 다제 내성을 나타내었다. 2004년에는 전체 8주 중에서 5주가 3가지 약제에 대해 다제 내성을 나타냈으며, 2005년에는 전체 3주 중에서 2주가 6가지 약제에 대해 다제 내성을 나타내었다.

Fig. 1. Plasmid profiles of S. flexneri isolated from patients.

Lane M ; Lambda DNA/HindⅢ

Lanes 1 to 22 ; S. flexneri isolates

M  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  M

A.

(kb)

23.1-

9.4-

6.5-

4.3-

2.3-

2.0-

M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 M

B.

(kb)

23.1-

9.4-

6.5-

4.3-

2.3-

2.0-

4. Plasmid 패턴 분석 결과

S. flexneri 22주의 plasmid profile을 분석한 결과 보유 plasmid의 수와 크기를 기준으로 5종(P1-P5)의 plasmid 유형으로 분류할 수 있었다(그림 1). P1은 4개의 plasmid band를 갖는 group으로 전체 22주 중 1주(4.5%)가 보유하고 있었다. P2는 3개의 band를 갖고 있으며 11주(50.0%)가, P3는 7개의 band를, P4는 6개의 band를 가지며 각 각 1주(4.5%)씩 보유하고 있었다. P5는 4개의 band를 갖고 8주(36.4%)가 보유하고 있었다. Plasmid profile을 분석한 결과 연도별 항생제 다제내성 패턴이나 혈청형과 유사한 양상을 보였다. 즉, 2002년에는 혈청형 2a가

Table 6. Prevalence of ShET-1, ShET-2, ipaH, stx and ial in Shigella flexneri according to the serotypes
Classification	Serotypes of S. flexneri					Total(%)
	2a	2b	3a	3b	4a
ShET-1A	9	3	0	0	0	12(54.5)
ShET-1B	9	3	0	0	0	12(54.5)
ShET-2	9	3	6	1	0	19(86.4)
ipaH	9	3	8	1	1	22(100.0)
ial	9	3	8	1	1	22(100.0)
stx	0	0	0	0	0	0(0)

주로 유행하였고, 7개의 약제에 대해 항생제 다제내성을 나타냈으며 plasmid는 P2의 형태가 주로 유행하였다. 2003년에는 4가지의 다양한 혈청형이 분리되었으며 6가지의 약제에 대해 다제내성을 나타냈으며, plasmid는 P2, P3, P4로 분석되었다. 2004년에는 혈청형 3a가 유행하였으며, 3가지의 약제에 대한 다제내성을 갖으며 주로 plsamid P5가 분리

Table 5. Ditribution of serotype, antibiogram, plasmid profile in the S. flexneri isolated from patients in Seoul from 2002 to 2005
Years	Serotype	Multi drug resistance pattern	Plasmid profile	No of isolates(%)	Total
2002	2a	AM-SAM-S-C-Te-TIC	P1	1(16.7)	6
		AM-SAM-S-Te-TIC-SXT	P2	4(66.7)
	2b	AM-SAM-S-C-Te-TIC-SXT	P2	1(16.7)
2003	2a	AM-S-C-Te-TIC-SXT	P2	1(20.0)	5
	2b	AM-S-C-Te-TIC-SXT	P2	2(40.0)
	3b	AM-SAM-S-Te-TIC	P4	1(20.0)
	4a	AM-S-C-Te-TIC-SXT	P3	1(20.0)
2004	2a	AM-S-Te-TIC-SXT	P2	1(12.5)	8
	3a	S-Te-SXT	P5	7(87.5)
2005	2a	AM-S-C-Te-TIC-SXT	P2	2(66.7)	3
	3a	S-Te-SXT	P2	1(33.3)
Total					22

되었다. 2005년에는 2a가 유행하였으며, 6가지의 약제에 대해 다제내성을 갖고, P1의 형태가 주로 유행한 것으로 분석되어 진다(표 5).

5. PCR법에 의한 병원성 유전자 검출

분리된 22주 Shigella flexneri의 enterotoxin, ipaH, ial, Stx gene의 병원인자 특성은 표 6과 같았다. 장관독 1의 ShET-1A와 ShET1B를 코딩하는 set1A와 set1B 유전자 증폭 반응에서는 12주(54.5%)가 양성을 나타냈으며 ial유전자와 shig를 코딩하는 ipaH유전자 증폭 반응에서는 22주(100%) 모두 양성을 나타냈으며, ShET2를 코딩하는 sen유전자 증폭 반응에서는 19주(86.4%)가 양성을 나타냈으며, stx유전자는 모두 음성(100%)을 나타내었다.

분리된 22주의 enterotoxin, ipaH, ial, stx gene의 혈청별 병원인자 특성은 분리된 22주 모두 ial, ipaH gene을 갖고 있었으나 stx gene은 갖고 있지 않았다 . S. flexneri 2a형 9주는 모두 ShET-1A, ShET-1B, ShET-2을 갖고 있었다. S. flexneri 3a 8주는 ShET-2 gene을 6주(75.0%)가 갖고 있었으며, S. flexneri 3b 1주는 ShET-2 gene을 갖고 있었다.

고  찰

Shigella 균속에 의한 감염은 식생활 습관, 식품 제조공정 그리고 환경 등의 위생상태에 따라 그 발생빈도가 다르게 나타나고 설상증의 잠복기는 약 2～7일로, 복통, 열, 설사 때로는 혈변을 동반하기도 한다. Shgella 균속에 의한 감염은 범세계적으로 소규모 집단 형태로 발생되고 있으며, 위생상태가 청결치 못한 개발도상국 뿐만 아니라 위생상태가 현저히 개선된 구미선진국에서도 환자 발생이 지속되고 있다.

본 연구에서 Shigella 균속의 병원성과 관계가 있는 여러 가지 병원 인자들이 조사되었다. 대장에서 세균은 점막세포를 침습한다. 침습에 포함된 유전자의 일부가 동정되었고 침습성 플라스미드 항원에 대한 것은 ipa라고 표시되었다. 그러나 이들 유전자 중 하나인 ipaH 유전자는 60kDa 항원을 기억하고 있으며, 침습 관련 플라스미드와 염색체 모두에서 발견되며, 유전학적으로나 면역학적으로 중요한 것으로 알려져 있다(17). 본 연구에서 PCR을 실시한 결과 모든 균주에서 ipaH 유전자는 모두 검출되었으나 plsamid의 소실과 ipa 유전자들의 소실은 비교적 높은 비율로 일어나며, 그 결과로 침입성과 병원성을 상실하게 되므로 ipa 유전자의 유무가 병원성의 절대적 지표는 아니다(18). Shigella균에 의해 세포침습에 관련된 또 다른 병원인자는 플라스미드에 존재하는 ial유전자이며, 연구한 22균주는 모두 이 유전자에 대하여 양성을 나타내었다. 2종의 새로운 장관독인 ShET-1(set1)과 ShET-2(sen)도 중요한 병원인자이며, 세균성 이질 환자에서 수양성 설사는 ShET-1과 ShET-2의 두 종류의 장관독소 합성에 의한 것으로 최근에 밝혀졌으며 Noriega 등(9)의 보고에서는 ShET-1은 S. flexneri 2a에서 대부분이 발견된다고 하였으며, 본 연구에서는 9주의 2a형에서 모두 발견되었고, 3주의 2b형에서도 발견되어 Noriega 등의 보고와 일치하였다. Nataro 등(10)은 DNA probe를 이용하여 연구한 S. flexneri의 73%가 sen gene(ShET-2)을 갖고 있으며, Vargas 등(19)은 50%만이 이 gene을 갖고 있다고 보고하여 본 실험의 86.4%보다 낮았다. 또한 이질균 중에서는 유일하게 S. dysenteriae 균주만 생성하는 것으로 알려져 있는 stx유전자는 본 연구의 PCR 결과 모두 음성으로 확인되었다. 그러나 최근 이 등(20)의 연구에서는 S. flexneri와 S. sonnei의 모든 실험균주에서 stx유전자가 발견되었다고 보고된 바가 있으며, 이와 같은 사실은 병원성인자의 유무에 따라 균종간 혈청형별로 병원성이 다양한 양상을 나타내는 것으로 생각되어지며, 앞으로 stx 유전자의 작용기전에 대한 활발한 연구활동과 더불어 좀 더 신속하고 정확한 연구결과를 위하여 재현성이 높고 특이적인 primer의 설계가 절실히 요구된다.

항생제 치료는 질병의 강도와 기간을 줄일 수 있으며, 2차 감염과 사망을 예방하고, 균의 분산을 막기 때문에 Shigellosis에서 권장되고 있다(21,22). 본 실험에서 분리된 S. flexneri 22주에 대한 항생제 검사에서는 S와 Te는 100%, SXT는 77.3%의 내성율을 나타낸 반면, AN, K, FOX, GM은 100%, CRO는 95.5%, CIP는 90.9%, NA는 86.4%의 감수성을 나타내어 과거 다수 사용한 항생제에 대해서는 내성이 높은 반면 사용빈도가 낮은 세파계 항생제와 GM, AN에 대한 감수성은 높아, 사용빈도에 따른 내성율의 차이를 나타내었다. 본 실험에서 다제 내성은 22개의 균주 모두 3가지 이상의 약제에 대해 다제 내성을 나타냈으며, 2002년에서 2005년 사이 유행한 다제 내성 양상도 각 연도별로 차이를 보였다.

항균제 내성균이 증가하는 것은 특정 균주나 특별한 내성 plasmid의 확산 또는 다양한 균주를 통한 다양한 plasmid의 확산의 결과라 할 수 있으며, 그러한 가능성을 조사하기 위해서 plasmid의 분석은 필수적이라 생각된다(23). Shigella spp.은 2～10개의 다양한 plasmid를 가지고 있으며, 약 220kb의 큰 plasmid는 장 침입에 관련되므로 병원성을 나타내는데 필수적이다(24,25) 하지만, 큰 plasmid는 배양과정 중 세포 내에서 쉽게 유실되거나 유전자 첨가나 결실 등을 통해 변화가 일어나게 되며, 이 plasmid가 없는 균주는 설사를 발생할 능력이 없다고 보고되었다(26). 본 연구에서는 큰 plasmid에 관련되어 있는 invasion plas-mid antigen H(ipaH) 유전자를 확인하여 22개의 모든 균주에 존재하고 있음이 확인되었다. 세계 여러 지역에서 분리된 Shigella spp.는 작은 plasmid를 가지고 있다고 알려져 있으며, 이 작은 plasmid는 항생제 내성과 관련이 있다는 보고도 있으나 자세하게 보고된 바가 없다(27). 본 연구에서 사용된 22개의 S. flexneri는 P1, P2, P3, P4, P5의 5가지 유형으로 구분할 수 있었다. 이것은 2002년에서 2005년 사이 각 연도별로 다르게 나타난 항생제 다제 내성 패턴과 유사하게 나타났다. 2002년에 주로 유행한 혈청형은 2a였으며 다제 내성 패턴은 AM-SAM-S-C-Te--TIC-SXT이며 P2형이 주로 발견되었다. 2003년에는 2a, 2b, 3b, 4a의 다양한 혈청형이 나타났으며 AM-S-C-Te-TIC-SXT의 항생제 패턴과 함께 P2, P3, P4의 plasmid 패턴이 확인되었으며, 2004년에는 3a의 혈청형이, S-Te-SXT의 항생제 패턴과 P5의 plasmid유형이 발견되었다. 2005년에는 2a가 주로 발견되었으며, AM-S-C-Te-TIC-SXT의 항생제 유형이 나타났고, P2의 plasmid 유형이 발견되어 항생제 다제 내성 패턴과 plasmid profile의 유형이 어느 정도 일치한다고 본다.

이상의 결과로 볼때 쉬겔라균의 항생제 남용에 의한 다제 내성이 매우 심각하다고 생각되어, 앞으로의 쉬겔라균에 대한 항생제 치료는 매우 신중하게 다루어져야 할 것으로 생각된다. 나아가 항생제 내성 양상에 대한 내성 전달 여부와 plasmid와 항생제 내성의 관계를 밝힐 수 있는 심도 있는 연구도 있어야 할 것으로 사료된다.

결  론

2002년에서 2005년에 서울시에서 집단 혹은 산발적으로 발병한 세균성 이질 환자에서 분리한 S. flex--neri 22균주에 대하여 생화학적 성상, 혈청학적 검사, 항생제 내성 검사, plasmid profile을 분석하였으며, PCR법을 이용하여 set1A, set1B, sen, ipaH, ial 및 stx 유전자들의 유무를 검사한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 분리된 22주에 대해 혈청학적 검사를 실시한 결과  S. flexneri 2a는 9주(40.9%), 2b는 3주(13.6%), 3a는 8주(36.4%), 3b와 4a는 각각 1주(4.5%)로 나타났으며, 2002년에는 2a(83.3%),  2004년에는 3a(87.5%)가 주로 유행한 것으로 나타났다.

2. 항생제 내성 검사를 실시한 결과 strepto-mycin과 tetracycline은 22주 모두 내성을 나타냈으며 trimethoprim/sulfamethoxazole은 77.3%의 내성을 나타냈으며. amikacin, ka-na-mycin, cefoxitin, gentamicin에는 22주 모두 감수성을 나타냈다. 그리고 22주 모두 3가지 이상의 약제에 다제내성 양상을 보였다.

3. 분리된 22주에 대해 plasmid profile을 실시한 결과 5가지의 패턴(P1, P2, P3, P4, P5)이 나타났으며, 이것은 연도별로 나타난 항생제 다제내성 양상과 혈청형과 일치하였다.

4. PCR법을 이용하여 set1A, set1B, sen, ipaH, ial 및 stx 유전자들의 유무를 확인한 결과 22주 모두 ipaH와 ial유전자를 보유하고 있었다. set1A와 set1B를 보유하고 있는 주는 12주(54.5%)였으며, sen 유전자를 보유하고 있는 주는 19주(86.4%)였다. 그러나, stx 유전자를 보유하고 있는 주는 본 연구에서 검출되지 않았다.

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