서울特別市 保健環境硏究院報 第50號	(2014)

Report of S.I.H.E., 50:102~111	(2014)

다종농약다성분 분석법을 이용한

농산물 중 Tebuconazole 분석

잔류농약검사팀

김윤희․이정숙․박경애․정소영․조성애․김남훈

한성희․김희선․이새람․이정미․유인실․정  권

Analysis of Tebuconazole Residues in Agricultural Products Using a Multi-residue Analytical Method

Residue Pesticide Inspection Team

Yun-hee Kim, Jeong-sook Lee, Kyung-ai Park, So-young Jung,

Sung-ae Jo, Nam-hoon Kim, Sung-hee Han, Hee-sun Kim,

Sae-ram Lee, Chung-mi Lee, In-sil Yu and Kweon Jung

Abstract

In this study, we aimed to validate a method of analyzing tebuconazole via simultaneous determination of multiple pesticides by gas chromatography with a nitrogen-phosphorus detector(NPD). We analyzed tebuconazole in five representative samples(brown rice, potato, soybean, mandarin orange, and green pepper) by multi-class pesticide multi-residue method 2, as described in the Korea Food Code. We tested linearity, LOD(limit of detection), LOQ(limit of quantitation), accuracy, and precision. The calibration curve of tebuconazole was linear over the concentration range of 0.02~3.14 mg/L, with a correlation coefficient > 0.999. The limits of detection were 0.008 mg/kg and 0.010 mg/kg for DB-1701 columns and DB-5 columns, respectively. The limits of quantitation were 0.022 mg/kg for a DB-1701 column and 0.032 mg/kg for a DB-5 column. Mean recovery rates were 73.74~107.60% at the level of 0.37 mg/kg and 65.10~98.61% at the level of 2.96 mg/kg. Relative standard deviation(RSD) in recovery rates were all < 10%. The RSD of intra-assay and intermediate precision were 0.47~1.53 and 5.15~7.64%, respectively. The result indicated that this method was an accurate, reproducible, and sensitive method for the analysis of tebuconazole in agricultural commodities.

Key words : Tebuconazole, multi class pesticide multiresidue methods, validation

서  론

Tebucoanzole은 1990년 독일의 Bayer사에서 개발한 triazole계 살균제로서 각종 식물병원균의 세포막 형성에 필수적인 steroid 생합성 과정 중 ergosterol의 생합성 단계를 저해하는 EBI계 살균제로 국내에서 사과, 고추, 차 포도, 구기자 등의 탄저병, 마늘의 흑색썩음균핵병, 감귤의 잿빛곰팡이병, 대추와 파의 녹병 등의 방제효과를 위해 광범위하게 사용되는 농약이다(1~4).

Fig. 1. Chemical structure of tebuconazole.

최근 몇 년간 서울 강북지역 유통 농산물의 tebuconazole의 검출이력을 살펴보면, 2008년 달래, 고춧가루, 사과에서 19건이 검출되었고, 2009년 고추, 포도, 브로콜리에서 5건, 2010년 고추, 고춧가루, 고춧잎, 녹차, 배추, 달래, 셀러리, 아욱, 사과에서 32건, 2011년 고추, 곶감, 미나리, 배추, 쑥갓, 참나물, 파, 사과에서 15건, 2012년 고추, 고춧가루, 고춧잎, 사과, 쪽파에서 20건이 검출되었고 이중 3건은 식품의 농약 잔류허용기준을 초과하였으며, 2014년 고춧가루에서 23건 검출되었다(5).

이처럼 tebuconazole은 다양한 식품에 잔류하는 농약으로서 국제식품규격위원회(Codex) 산하 국제잔류농약전문위원회(Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues, JMPR)에서 일일섭취허용량(acceptable daily intake, ADI)을 0.03 mg/kg b.w./day로 정하고 있으며, Codex 식품 및 사료의 농약잔류허용기준을 보면 사과 등 58종의 식품 및 사료에 대한 기준이 설정되어 있고, 국내 식품 중 농약의 잔류허용기준은 고추를 비롯한 30가지 품목에 대하여 0.05~15 mg/kg b.w./day 수준으로 관리하고 있다(6, 7).

국내에서 식품 중 잔류농약 분석법은 식품의약품안전처의 고시에 의해 단성분 분석 및 다성분 분석으로 나뉘어져 있으며, 다성분 분석법의 경우 다종농약다성분분석법 제1법과 제2법으로 구분되어 있다. 제1법과 제2법은 시료 전처리 과정의 추출 용매와 정제과정이 다르며, 국내에서 식품의 잔류농약을 분석하는 국가기관이나 민간기관들은 두 방법 중 하나를 선택하여 사용하고 있다. Tebuconazole은 현재 식품공전 중 식품 중 잔류농약 분석법의 다종농약다성분분석법 제1법의 분석대상 농약이며, 정밀한 분석을 위한 개별 분석법이 정해져 있다(8, 9). 다종농약다성분분석법 제1법과 tebuconazole 개별 분석법은 시료 추출 후 농축과정에서 긴 시간이 소요되며, 정제 시 유리 칼럼과 많은 양의 용매를 사용해 시간이 오래 걸리므로 다종농약다성분분석법 제2법에 비해 재료나 시간적인 면에서 번거롭기 때문에, 하루에 여러 종류의 잔류농약을 분석하여 신속하게 처리하는 실험실에서 적용하기에는 다소 어려운 실정이다.

따라서 본 연구는 다종농약다성분분석법 제2법으로 tebuconazole을 분석하고 분석법의 유효성을 검증하여 농산물 중 tebuconazole 분석 시 보다 신속하고 정확한 분석법을 제시하고자 한다.

재료 및 방법

1. 시약 및 기구

Tebuconazole 농약 표준품은 Dr. Ehren- storfer GmbH(Germany) 제품을 사용하였으며, 일반시약은 잔류농약분석용 및 GC용을 사용하였다. 분석기기는 GC-NPD 7890A(Agilent Technolo- gies, USA)를 사용하였고, 정성분석은 GC-MSD (Agilent 5975C, USA)를 이용하였다(******).

2. 분석 시료

분석 대상 농산물은 식품의 농약 잔류허용기준의 식품원재료 분류표(6)에 따라 곡류 중에서는 현미, 서류는 감자, 콩류는 대두, 과일류는 감귤, 채소류는 고추로 총 5종의 대표 농산물 시료를 선정하였다. 각각의 농산물은 2014년 10월부터 12월까지 서울 강북지역의 유통 농산물 중에서 농약이 검출되지 않은 것을 폴리에틸렌 필름에 밀봉 후 4℃ 이하로 냉장 보관하여 사용하였다.

3. 표준용액조제

Tebuconazole 표준품을 acetone에 용해시켜 100~200 mg/L 농도로 표준원액을 조제하였으며, -18℃ 이하 냉동고에 보관하였다. 이 원액을 20% acetone/hexane으로 희석하여 0.02~3.14 mg/L의 농도로 만들어 사용하였고, 정확한 실험을 위해 10일 간격으로 표준원액을 새로 조제하였다.

Instrument	GC-NPD
Detector	Nitrogen-phosphorus detector
Column	DB-1701 14% Cyanopropyl phenyl 86% Methyl Polysiloxane (30 m × 320 ㎛ ID × 0.25 ㎛ film thickness)
	DB-5 5% Phenyl 95% Mehtyl Polysiloxane (30 m × 320 ㎛ ID × 0.25 ㎛ film thickness)
Oven temp.	110℃(1 min) → 15℃/min → 200℃(8 min) → 10℃/min → 260℃(8 min)
Injection temp.	210℃
Detector temp.	320℃
Gas flow	N2 1.4 mL/min
	Air 120 mL/min
	H2 3.0 mL/min

Table 1. Analytical conditions of GC-NPD

Table 2. Analytical conditions of GC-MSD

Instrument	GC-MSD
Column	DB-5MS 5% phenyl methyl siloxane(30 m × 250 ㎛ ID × 0.25 ㎛ film thickness)
Oven temp.	100℃(2 min) → 10℃/min → 320℃(5 min)
Injection temp.	230℃
Gas flow	He(splitless, 1.0 mL/min)
Detector : MSD	Ionization method	Electron impact at 70 eV
	Ion source temp.	230℃
	Transfer line temp	280℃
	Scan range	50-550 m/z(2.91 scan/sec)

4. 시료 추출 및 정제

Tebuconazole 분석을 위한 시료의 전처리 방법은 식품공전의 식품 중 잔류농약 분석법의 다종농약다성분 분석법 제2법(8)에 따라 전처리하여 GC- NPD를 이용하여 분석하였다(****).

5. 분석 절차

1) 분석기기의 검출한계 및 정량한계

Tebuconazole 표준원액을 0.12~0.49 mg/L로 조제한 후 5회 반복 주입하여 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantita- tion, LOQ)를 측정하였다. 계산 방법은 y절편의 표준편차(standard deviation, SD)를 검량선의 기울기로 나눈 값으로 구하였고, 그 식은 아래와 같다.

검출한계 = 3.3 × (표준편차/기울기)

정량한계 = 10 × (표준편차/기울기)

2) 직선성

Tebuconazole 표준용액을 0.02~3.14 mg/L의 범위에서 5개 농도로 조제하여 5회 반복하여 측정하였다.

Fig. 2. Schematic diagram of multiresidue analysis of pesticides with GLC.

3) 정확성

농약이 검출되지 않은 현미, 감자, 대두, 감귤, 고추에 tebuconazole 표준용액을 0.37, 2.96 mg/ kg의 농도로 첨가한 후 회수율 시험을 통해 확인하였고, 각 시료별로 3회 반복 실험하였다.

4) 정밀성

반복성(repeatability, intra-assay precision) 과 실험실내 정밀성(intermediate precision) 시험을 하였으며, 반복성이란 실험실 내에서 동일한 시험자가 동일한 장치와 기구, 시약, 기타 동일 조작 조건하에서 균일한 검체로부터 얻은 복수의 검체를 짧은 시간차로 반복 분석하여 얻는 측정값들 사이의 근접성을 평가하는 것으로 tebuconazole 표준용액을 0.11, 0.55, 1.10 mg/L 로 조제하여 분석기기에 각 농도별로 5회 이상 반복 주입하여 측정하였다.

실험실내 정밀성은 동일한 실험실 내에서 다른 실험일, 다른 시험자, 다른 기구 등을 이용하여 분석하여 얻은 측정값들 사이의 근접성을 말하는데, 본 실험에서는 반복성 시험과 동일한 실험실 내에서 동일한 조건으로 실험일자만 달리하여 3일간 반복 측정하여 평가하였다.

결과 및 고찰

1. 분석기기의 검출한계 및 정량한계

GC-NPD에서 tebuconazole의 머무름시간은 DB-1701 칼럼은 19.01분, DB-5 칼럼은 22.29분 으로 나타났고, 검출한계와 정량한계는 다음과 같다(***).

Table  3.  Limits of detection and quantitation of DB-1701 and DB-5 column

Fig. 3. Calibration curves of tebuconazole for column DB-1701(A) and DB-5(B).

	LOD1)(mg/kg)	LOQ2)(mg/kg)
DB-1701	0.008	0.022
DB-5	0.010	0.032

1) LOD : Limit of detection

2) LOQ : Limit of quantitation

2. 직선성 및 범위

Tebuconazole 표준용액을 3.14, 1.10, 0.55, 0.11, 0.02 mg/L로 조제하여 calibration curve를 작성하였으며, 5번 반복 주입하여 평균값을 측정하였다. 최저 농도는 정량한계를, 최고농도는 회수율 시험 농도를 포함하는 수준으로 정하였다.

상관계수(coefficient of correlation, r2)는 DB-1701 칼럼은 5번 반복시험결과 평균 0.9999이상이었고, DB-5 칼럼의 경우 평균 0.9995 이상으로 두 가지 컬럼 모두 1.0에 가까운 양호한 직선성을 나타내었다(****).

3. 정확성

측정된 회수율 범위와 분석오차 결과에 근거하여 분석법의 정확성(accuracy)과 재현성(reproducibility)을 평가할 수 있는데, 국내에서 분석법 검증을 위한 회수율 허용 범위는 70~120%이며, 분석오차 즉, 반복 회수율 수치간 변이계수(cofficient of variance, CV) 또는 회수율 수치 간 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 20% 이하이다(4). 국제 기준은 분석성분의 처리 수준에 따라 허용범위가 상이하게 설정되어 있으며, 처리수준이 [eqn: >]0.1~≤1.0 mg/kg 일 때 회수율 허용범위는 70~110%, 분석오차 최대 허용치는 15%이고, 처리수준이 [eqn: >]1 mg/kg 일 때 회수율 허용범위는 70~110%, 분석오차 최대 허용치는 10%이다(10).

5가지 대표 시료의 회수율 시험결과, 현미의 회수율이 98.61~107.60%로 가장 높게 나타났고, 감귤이 가장 낮은 회수율을 보였다. 감자와 고추는 첨가한 tebuconazole의 농도가 0.37 mg/kg 보다 2.96 mg/kg에서 더 높은 회수율이 나타났고, 대두는 두 가지 농도에서 비슷한 회수율을 나타내었다(***). 감귤을 제외한 현미, 감자, 대두, 고추의 회수율은 국내 및 국제 허용 범위를 만족하는 결과를 나타냈고, 감귤은 2.96 mg/kg 농도에서 회수율이 65.10%로 국내 및 국제 허용범위를 충족하지 못했다. 균질화한 감귤을 pH 시험지로 측정한 결과 pH 4 수준으로 나타났는데 감귤의 낮은 pH가 분석과정의 회수율에 영향을 미쳤을 것으로 사료된다. 감귤과 같이 pH가 산성을 띠는 식품의 잔류농약분석은 앞으로 더 연구해 볼 필요가 있을 것 같다.

분석오차는 5가지 시료 모두 10% 미만으로 국내 및 국제 허용기준을 만족하였다. 즉, 감귤을 제외한 4가지 시료의 회수율은 정확성 및 재현성 평가 결과 우수하다고 사료된다.

GC-NPD로 분석한 크로마토그램은 ****와 같다.

4. 정밀성

반복성(repeatability, intra-assay precision) 시험 결과 tebuconazole 표준용액 0.11, 0.55, 1.10 mg/L의 머무름 시간(retention time)은 평균 22.29 ± 0.002분이었으며, 측정값들의 상대표준편차는 낮은 농도부터 1.53%, 1.48%, 0.47%로 나타났다. 실험실내 정밀성(intermediate precision) 시험의 머무름 시간은 3일 평균 22.28 ± 0.002분으로 오차가 거의 없었으며, 측정값들의 상대표준편차는 5.15~7.64%로 반복성과 실험실내 정밀성 시험 모두 분석오차 10% 미만이므로 정밀성이 우수하다고 사료 된다(***).

Table 4. Recovery rates of tebuconazole in agricultural products

Agricultural product	Spiked amount(mg/kg)	Recovery rate(%)	±SD	RSD(%)
Brown rice	0.37	107.60	4.31	4.00
	2.96	98.61	3.72	3.77
Potato	0.37	73.74	2.12	2.88
	2.96	90.23	5.05	5.59
Soybean	0.37	86.72	5.51	6.36
	2.96	85.76	7.96	9.28
Mandarin	0.37	78.03	2.49	3.20
	2.96	65.10	4.52	6.94
Green pepper(fresh)	0.37	85.27	3.41	4.00
	2.96	95.75	0.79	0.82

Table  5.  Results of intra-assay and intermedi- ate(over a period of 3 consecutive days) precision study

Concentration (mg/L)	Precision
	Intra-assay	Intermediate
0.11	1.53	6.74
0.55	1.48	5.15
1.10	0.47	7.64
Mean of retention time	22.29±0.002	22.28±0.002

5. GC-MSD를 이용한 시험법의 재확인

분석된 잔류분의 신뢰성을 확보하기 위하여 GC-MSD의 분자량 범위 50~500 m/z의 스캔모드에서 tebuconazole 표준용액과 회수율 검체를 주입하여 총이온크로마토그램과 스펙트럼을 확인하였고, fragment ion은 250.1, 125, 83.1 등으로 나타났다(****).

Fig.  4.  GC-NPD chromatograms of control of brown rice extract(a), a tebuconazole standard solution of 2.96 mg/kg(b) and a spiked brown rice at 2.96 mg/kg of tebuconazole (recovery, c).

Fig.  5.  GC-MSD total ion chromatograms and mass spectra of tebuconazole standard 2.9 mg/kg(A), spiked potato at 2.96 mg/kg of tebuconazole(recovery, B).

요  약

본 연구는 농산물에 존재하는 tebuconazole의 분석을 위해 GC-NPD를 이용하여 식품공전의 다종농약다성분분석법 제2법에 대한 분석법의 유효성 검증을 하고자 수행하였다.

1. 분석기기의 검출한계와 정량한계는 DB-1701 칼럼은 0.008과 0.022 mg/kg, DB-5 칼럼은 0.010과 0.032 mg/kg 이었다.

2. Tebuconazole 표준용액을 0.02~3.14 mg/L 범위에서 검량선의 직선성을 알아본 결과 DB- 1701 칼럼의 상관계수는 0.9999, DB-5 칼럼은 0.9995 이상으로 두 가지 칼럼 모두 직선성은 양호하였다.

3. 현미, 대두, 감자, 감귤, 고추 중 tebuconazole의 회수율은 감귤을 제외한 4가지 시료의 회수율이 73.74~107.60%로 국내 및 국제 회수율 허용기준을 만족하였고, RSD는 5가지 시료 모두 10% 미만으로 국내 및 국제 분석오차 최대허용치 이내였다.

4. 반복성과 실험실내 정밀성 시험 결과, 측정값들의 상대표준편차가 반복성 시험은 0.47~ 1.53%, 실험실내 정밀성 시험은 5.15~7.64%로 측정값들의 근접성이 우수하게 나타났다.

본 연구의 다종농약다성분분석법 제2법에 대한 농산물 중 tebuconazole 분석 결과 검출한계, 정량한계, 직선성, 정확성, 재현성 및 정밀성 등을 고려할 때 농산물 중 tebuconazole의 잔류 분석법으로 가능하다고 판단된다. 또한, 시료 추출 및 정제과정에서 유리 칼럼과 많은 양의 용매를 사용하는 다종농약다성분분석법 제1법과 tebuconazole 개별 분석법에 비해 검사시간을 단축하는 효과가 있으므로, 여러 종류의 잔류농약을 동시에 분석하는 실험실에서 tebuconazole을 분석할 때, 보다 적합한 분석 방법이라고 사료된다.

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