야생조류 AI 진단 매뉴얼

2017. 11.

차  례

Ⅰ. 시료접수 및 결과통보	1

1. 시료접수

2. 결과통보

Ⅱ. 조류인플루엔자 진단	6

1. 시료채취

2. Real-time RT-PCR 검사

3. 종란접종법

4. HA 및 Real-Time RT-PCR 검사

Ⅲ. 시료 수송방법	16

1. 양성반응 시료 통보

2. 시료 수송

Ⅳ. 고병원성 AI 발생시 대응방법	18

1. 시료채취

2. 조류인플루엔자 진단

3. 양성반응 시료 통보

4. 시료 수송

Ⅴ. 천연기념물 신고요령	20

1. 천연기념물 멸실신고

2. 천연기념물 현상변경 신청

3. 천연기념물 착수 및 완료 신청

4. 시료 수송

[야생동물 질병진단 흐름도]

[야생동물 질병진단 목록]

구 분	소 속	부서
지방정부	인천광역시 보건환경연구원	방역관리과
	광주광역시 보건환경연구원	동물방역과
	경기도 동물위생시험소	동물위생시험소
	세종특별자치시 가축위생연구소	가축위생연구소
	경상북도 동물위생시험소	동물위생시험소
	서울특별시 보건환경연구원	동물위생시험소
	대전광역시 보건환경연구원	동물위생시험소
	경상남도 축산진흥연구소	축산진흥연구소
유관기관	강원대학교	수의과대학
	충북대학교	수의과대학
	경북대학교	수의과대학
	경상대학교	수의과대학
	전북대학교	수의과대학

Ⅰ	시료접수 및 결과통보

시료 접수

○ 지방자치단체로부터 시료 접수

- 지자체로부터 유선연락 및 공문을 통해 시료 접수

- 야생동물 시료 접수절차 안내

· 야생동물 질병진단 의뢰서 작성 [서식 1]

· 시료 수거 및 운송방법 안내(포장 및 냉장상태 등) [붙임 1]

- 야생동물 질병진단 의뢰서를 통해 시료정보 확인

○ 시료접수내역 통보

- 지자체가 공문을 발송 할 경우 수신자에 ’국립환경과학원 환경보건연구과‘를 포함하여 발송하도록 안내

- 담당자 : 국립환경과학원 환경보건연구과 생물안전연구팀

김용관 연구사 (032-560-7146 / *************)

손기동 전문위원 (032-560-7152 / *************)

결과 통보

○ 질병진단 후 국립환경과학원 및 지자체에 진단결과 통보

- ‘음성’으로 진단된 시료는 공문을 통해 진단 결과통보

- 음성시료의 진단결과는 지정 기간 내 통보

· 1차 검사(Real-time RT-PCR) : 시료 수령 후 3일 이내

· 종란접종 : 시료 수령 후 9일 이내

○ 진단결과 ‘양성’ 으로 판정된 경우

- 1차 검사결과 ‘양성’ 또는 ‘의양성’으로 판정된 즉시 국립환경과학원으로 유선연락 및 시료정보를 첨부하여 공문 통보

- 공문 발송을 할 경우 과학원과 지자체에 동시 통보

※ 양성판정 기준은 아래 ‘Real-Time RT-PCR 진단’ 부분을 참고

○ 야생동물 질병진단 결과 통보

- ‘음성’으로 판명된 경우 공문으로 결과를 통보

[조류인플루엔자 정밀검사 작성 예시_음성판정]

채취장소	시료내역	시료수령일	결과판정일	검사방법	검사결과
OO시 OO군 OOOO 인근	야생조류 폐사체 (흰뺨검둥오리 2 수)	‘17.00.00	‘17.00.00	rRT-PCR	AIV 음성
OO시 OO군 OOOO OOO-OO	야생조류 폐사체 (붉은머리오목눈이 5 수)	‘17.00.00	‘17.00.00	종란접종	AIV 음성

- ‘양성’으로 판명된 경우 유선연락 후 공문 통보

[조류인플루엔자 정밀검사 작성 예시_양성판정_PCR]

채취장소	시료내역	시료수령일	결과판정일	검사방법	검사결과
OO시 OO군 OOOO 인근	야생조류 폐사체 (흰뺨검둥오리 2 수)	‘17.00.00	‘17.00.00	rRT-PCR	AIV 양성 Ct 값 : 30 (M)

[조류인플루엔자 정밀검사 작성 예시_양성판정_종란접종]

채취장소	시료내역	시료수령일	결과판정일	검사방법	검사결과
OO시 OO군 OOOO OOO-OO	야생조류 폐사체 (붉은머리오목눈이 5 수)	‘17.00.00	‘17.00.00	종란접종	AIV 양성 Ct 값 : 20 (M) 23 (H5)

· 종란의 결과일(D/K), HA 검사결과가 포함된 종란접종 대장기록을 첨부하여 공문발송

※ 종란접종 대장 작성법은 아래 ‘종란접종법’ 참고

○ 질병진단은 「야생동물질병 진단 접수 및 처리대장」[서식2]을 기록하며, 추후 진단수수료의 근거 자료로써 활용함

- 검사 항목별로 진단 수수료를 산정하여 의뢰 건수마다 지급

동일 건에 대해 수행한 검사 항목을 모두 산정하여 지급

진단수수료는 연단위로 총 검사건수에 대한 수수료를 질병진단기관에 지급

[서식 1. 야생동물 질병진단 의뢰신청서]

				접수번호
질 병 진 단 의 뢰 서
신 청 인	성 명		연 락 처
	소 속 명
	메일주소		팩스번호
	결과통보 방법	☐ 공문 ☐ 팩스 ☐ 메일
발생상황	최초발견일		검사의뢰일
	발견장소
	의뢰 개체 수		발견된 개체 수
	종 분류
	기타
주변환경
야생생물 보호 및 관리에 관한 법률 제34조의 제7항 규정에 의하여 위와 같이 의뢰합니다. 년 월 일 신 청 인 (서명 또는 인) 국립환경과학원장 귀하

[붙임 1. 폐사체 시료 수거 및 운송방법]

야생동물 폐사체 시료 수거 및 운송방법

야생동물 폐사체에 대한 질병진단 신청이 접수 된 경우 시료 운송방법을 안내

○ 수거 및 운송방법

1. 야생동물 폐사체를 발견할 경우 개인 보호장구를 착용한 뒤 수거함

※ 개인보호장구 : 방역장화, 방역복, 마스크, 위생장갑

2. 야생동물 폐사체를 수거 할 경우 폐사체와 발생 주변을 소독

3. 폐사체를 비닐백에 담고 케이블타이 등으로 비닐백을 밀봉

※ 비닐백은 멸균 Y-bag을 권장하며, 쓰레기봉투 등으로 대체 가능

4. 밀봉된 비닐백을 소독 후 이동상자에 담고, 아이스팩을 넣어 밀봉

※ 반드시 냉장상태를 유지하여 운송할 수 있도록 안내

5. 포장이 완료된 시료는 전문수송 위탁업체 또는 직접 수송하여 진단기관으로 전달 할 수 있도록 안내

< 개인 보호장구 착용 >

< 폐사체 수거 및 포장 >

[서식 2. 야생동물질병 진단 접수 및 처리대장]

야생동물질병 진단 접수 및 처리대장

접수 번호	접수일자	신청인		시료		처리 결과			확인
		성명	주소 <전화번호>	종명	내역	검사항목	진단명	처리일 <진단일>	담당자	책임자
00	17.00.00	oo시청	00시 00군 000길 000	흰뺨검둥오리	폐사체 1수	AI (종란접종*)	AI	17.00.00
00	17.00.00	oo군청	00시 00군 000길 000	청둥오리	폐사체 2수	AI (rRT-PCR)	음성	17.00.00

*종란접종 : 검사항목 중 ‘종란접종’은 Real-Time RT-PCR 까지 수행한 것으로 간주

Ⅱ	조류인플루엔자 진단

시료 채취

○ 조류인플루엔자(AI) 검사자 주의사항

- 모든 개인보호 장비는 1 회용을 원칙으로 함

- 시료채취에 사용되는 도구는 멸균된 도구를 사용

- 시료채취 후 폐기물은 반드시 적합한 방법으로 멸균 후 폐기

- 검사자에게 고열 등 AI 감염이 의심될 경우 가까운 의료기관에 방문하여 진료를 받고, 국립환경과학원에 연락하여 조치에 따름

○ 조류 종 동정

- 육안으로 종 분류가 불가능한 경우 반드시 부검 전 폐사체 시료의 사진을 촬영[붙임 2]하여 추후 검사 결과 통보 시에 첨부

○ 준비물

- 개인보호 장비 : 방역복, 덧신, 마스크, 수술용 장갑

- 부검도구 : 수술용 가위, 시료채집 용기, 소독제

- 시료채집 도구 : 면봉, 바이러스 분리용 멸균시험관, 50 ㎖ tube

○ 시료별 채취요령

- 스왑시료는 채취 후 1차 검사 완료 전까지 냉장보관

- 조직시료는 하나의 시료를 2개로 나누어 1개는 진단에 사용, 나머지 1개는 1차 검사 완료 전까지 50 ㎖ tube에 담아 냉동보관

※ 냉장보관 된 스왑시료 및 조직시료는 ‘양성’으로 판정된 이후 국립환경과학원에서 수거하여 확진검사 실시

1) swab시료 채취

① 멸균된 면봉 및 멸균시험관 준비

② 멸균시험관에는 항상제 (1% gentamicin)가 첨가된 PBS 5 ㎖을 넣어 준비

③ 폐사체의 입속 안쪽과 기관(Trachea) 부분을 면봉으로 충분히 굴려주어 상피세포가 묻을 수 있도록 채취

④ 폐사체의 총배설강에 면봉을 넣어 분변 및 상피세포가 묻을 수 있도록 충분히 굴려서 채취

⑤ 시료채취 후 면봉은 각각 다른 멸균시험관에 넣음

⑥ 채취된 시료는 15초 동안 vortexing하여 충분히 혼합하고  syringe filter(pore size : 0.45 ㎛)를 사용하여 필터 후 사용

⑦ 사용 후 남은 스왑시료액은 냉장 보관하여 ‘음성’으로 판정 시 적합한 방식으로 폐기하며, ‘양성’으로 판정 시 국립환경과학원에서 수거 함

2) 조직시료 채취

① 폐사체의 개복부위에 소독제를 분무

② 폐사체를 개복하여 췌장 및 신장조직을 채취(AI 검사용)

- 조직 채취 시 1개의 시료를 2개의 tube에 나누어 담고 1개는 1차 검사에 사용, 나머지 1개는 냉동보관 함 (1개 tube에 췌장, 신장 같이 넣음)

- 폐사체의 간, 폐, 맹장을 채취(AI 이외 질병 검사용)하여 6-well plate에 넣어 –20℃에 보관. 추후 국립환경과학원으로 연락 후 이송

③ 채취된 조직은 균질화 튜브 (homogenizer tube) 또는 막자사발 등을 이용하여 분쇄

※ 조직을 분쇄할 경우 항상제 (1% gentamicin)가 첨가된 PBS 5 ㎖을 넣어 상층액 분리가 가능하도록 함

④ 분쇄된 조직을 원심분리(6000xg/1min)하여 상층액을 분리

⑤ 채취된 시료는 syringe filter(pore size : 0.45 ㎛)를 사용하여 필터 후 1차 검사에 사용

⑥ 냉동보관 된 조직시료는 ‘음성’으로 판정 시 적합한 방식으로 폐기하며, ‘양성’으로 판정 시 국립환경과학원에서 수거 함

[붙임 2. 종 동정을 위한 사진촬영 방법]

종 동정을 위한 사진촬영 방법

○ 사진에 포함되어야 할 목록

1. 폐사체 시료의 전체 모습 (1장)

※ 크기를 가늠할 수 있는 도구를 놓고 촬영하며, 시료번호가 나올 수 있도록 종이 등에 적어 함께 촬영 함

2. 폐사체 시료의 머리 및 부리모양 (1장)

3. 날개와 꼬리를 펼친 상태에서 등 쪽에서 촬영 (1장)

4. 날개와 꼬리를 펼친 상태에서 배 쪽에서 촬영 (1장)

< 폐사체 사진촬영 모습(예시) >

2. Real-Time RT-PCR 진단

○ 1차 검사

- 스왑 및 조직시료 채취가 완료되면 해당 시료들에 대한 Real-time RT-PCR을 통해 1차 검사를 실시하고 조류 인플루엔자를 신속하게 진단 함

※ 단, 종란접종이 가능한 경우 Real-Time RT-PCR 검사를 생략하고 종란접종을 우선 수행함

○ 검출 대상

- 조류인플루엔자의 M · H5 · H7 유전자를 대상으로 검사수행

- M 유전자 검사는 NP 유전자 검사로 대체 가능

○ 조류인플루엔자 판정기준

- Real-Time RT-PCR을 통해 검사 할 경우 Ct 값을 근거로 조류인플루엔자를 진단 함

<조류인플루엔자 판정기준>

Ct 값	결과판정
M 유전자 : 36 이하	양성
H5/H7 유전자 : 40 이하

※ M 유전자가 ‘음성’ 일 경우 H5/H7의 결과는 모두 ‘음성’으로 간주

○ RNA 추출

- 스왑 및 조직시료 또는 종란접종 후 요막액 시료에 대해 Real-time RT-PCR을 통한 AI 검사를 실시하기 위하여 RNA를 추출함

- 아래 RNA 추출방식은 Qiagen사 QIAamp® Viral RNA mini Kit (Cat. No. 52906)을 사용한 경우이며, 다른 상용화된 제품도 사용 가능함

① carrier RNA가 포함된 AVL buffer 560㎕에 스왑액 또는 조직분쇄 상층액 140㎕를 혼합하여 15초간 vortexing 후 10분간 상온에서 정치함

② 에탄올 (96-100%) 630㎕를 위 ①번 혼합액에 넣고 15초간 vortexing 수행

③ column에 위 ②번 혼합액을 넣고 6,000 x g 속도로 1분간 원심분리 수행

④ column에 AW1 500㎕을 넣고 6,000 x g 속도로 1분간 원심분리 수행

⑤ column에 AW2 500㎕을 넣고 20,000 x g 속도로 3분간 원심분리 수행

⑥ Washing buffer (AW1/AW2)가 완전히 제거되도록 collection tube를 교체하여 column을 20,000 x g 속도로 1분간 원심분리 수행

⑦ column을 1.5㎖ 튜브에 옮긴 후 60㎕의 AVE를 넣고, 상온에서 약 1분간 정치 후 6,000 x g 속도로 1분간 원심분리 수행

⑧ elution이 완료된 RNA 시료는 추후에 Real-time RT-PCR에 사용하며, 남은 RNA 시료는 –70℃에서 보관

○ Real-time RT-PCR 검사

- Real-time PCR 검사에 사용된 장비는 ThermoFisher scientific사ABI QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System을 사용하였고, 조류 인플루엔자 검사용 Kit는 Qiagen 사의 QuantiTect Probe RT-PCR Kit (Cat. No. 204443)에 Primer 및 Probe를 혼합하여 사용함

※ 조류인플루엔자 중 M 또는 NP, HA 유전자를 검출 할 수 있는 다른 상용화된 Real-time PCR kit 또는 Primer & Probe set을 사용하여도 무방함

< Primer 및 Probe sequence >

Target region	Sequence		Nucleotide Position
M gene	Forward	5'-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3'	9-32
	Reverse	5'-TGCAAAAACATCTTCAAGTCTCTG-3'
	Probe	5'-FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-TAMRA-3'
H5 gene	Forward	5'-ACATATGACTACCCACARTATTCAG-3'	1,504-1,528
	Reverse	5'-AGACCAGCTAYCATGATTGC-3'
	Probe	5'-FAM-TCWACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-TAMRA-3'
H7 gene	Forward	5'-GGCCAGTATTAGAAACAACACCTATGA-3'	1,471-1,496
	Reverse	5'-GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT-3'
	Probe	5'-FAM-CCGCTGCTTAGTTTGACTGGGTCAATCT-BHQ-3'

검사방법

① QuantiTect Probe RT-PCR Kit의 프로토콜에 따라 master mix와 추출된 RNA를 혼합

Components	Volume
Foward primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
Reverse primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
Probe (10 pmol/㎕)	1 ㎕
2x QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix	25 ㎕
QuantiTect RT Mix	0.5 ㎕
RNA	5 ㎕
D.W.	16.5 ㎕
Total	50 ㎕

<Real-Time RT-PCR master mix 제조법>

② 다음과 같이 Real-time PCR 장비를 설정 후 PCR을 수행

	온도 (℃)	시간	Cycle
Stage 1 cDNA Synthesis	50	30 분	1
	95	15 분	1
Stage 2 PCR reaction	94	10 초	40
	55	30 초
	72	10 초

<Real-time PCR 반응조건>

③ 결과판정

1) M 유전자는 Ct 값 36 이하일 경우 양성

2) H5/H7 유전자는 Ct 값 40 이하일 경우 양성

※ M 유전자가 ‘음성’일 경우 H5/H7 결과는 모두 ‘음성’으로 판단 함

※ M 유전자가 ‘양성’일 경우 국립환경과학원에 유선으로 통보

- 담당자 : 국립환경과학원 환경보건연구과 생물안전연구팀

김용관 연구사 (032-560-7146 / *************)

손기동 전문위원 (032-560-7152 / *************)

3. 종란접종법

○ 종란접종의 수행

- 종란접종이 가능 할 경우 Real-Time RT-PCR과 동시에 또는 Real-Time RT-PCR 검사 이후에 종란접종을 수행 함 (권장)

- 종란접종이 불가능 한 경우 Real-Time RT-PCR만 수행하며, 양성 판정 시 스왑 및 조직시료는 국립환경과학원에서 수거 함

○ 발육란 취급요령

- AI 진단에 사용되는 발육란은 9 ~ 11일령을 사용

- 발육란은 검사 전까지 37℃ 부화기 또는 incubator에서 보관

- 검란용 램프를 이용하여 발육란의 혈관분포 및 폐사여부를 확인

○ 종란접종 방법

① 검란용 램프를 이용하여 발육란의 기실에 구멍을 낼 수 있는 곳을 확인 후 연필로 점 표시 함

※ 1개의 시료 당 3개 ~ 5개 종란을 준비

② 포비돈 솜으로 접종부위 주변을 소독을 실시하고 punch를 이용하여 점 표시된 부분에 구멍을 냄

③ 1cc 주사기를 이용하여 전처리가 완료된 시료를 0.1 ~ 0.2cc 접종

④ 파라핀액 또는 목공용 풀 등을 이용하여 접종부위를 막음

< 종란접종 모식도 >	[Andersson C et. al., Nat Protoc. 2015]

⑤ 접종이 완료된 종란은 37℃ 부화기 또는 incubator에서 배양하며, 접종 후 5일간 매일 폐사여부를 관찰 함

○ 종란접종대장 작성

- 시료를 종란에 접종한 경우 시료 및 접종조건 등을 기재함

- 접종 후 매일 검란을 실시하며, chilling, harvest 및 HA test 결과 등을 기록함 [별첨 1]

<별첨 1. 종란접종 대장 [예시] >

시료번호	시료내역			종란 번호	접종일	결과일 (D/K)*	HA 역가	비고
	의뢰기관	축종	시료형태
17-1	○○시 ○○군청	청둥오리	OP swab	17-1-1	17/9/25	3 D	128
				17-1-2	17/9/25	4 D	128
				17-1-3	17/9/25	5 K	64
17-2	○○시청	비둘기	CL swab	17-2-1	17/9/28	5 K	-
				17-2-2	17/9/28	5 K	-
				17-2-3	17/9/28	5 K	-

* : 종란접종 후 5일 내 폐사한 경우 D(dead)로 표시하며, 5일 내 폐사하지 않은 경우 K(killed)로 표시함. (예시) 접종 후 3일 후 폐사한 경우 : 3 D, 접종 후 5일 후까지 폐사하지 않은 경우 5 K로 표시함.

○ Chilling

- 검란기를 사용하여 접종된 종란을 매일 확인하고, 폐사했을 경우 종란을 4℃에서 18시간 chilling 시킴

- 접종 후 5일간 폐사하지 않은 종란의 경우도 위와 같이 4℃에서 18시간 chilling 시킴

○ Harvest

- Chilling이 완료된 종란은 70% 에탄올을 이용하여 소독

핀셋을 이용하여 기실 부분의 껍질을 벗김

종란 내 요막액을 멸균주사기 또는 피펫으로 수확함

수확된 요막액은 15 ml 또는 50 ml 튜브에 보관하며, 수확이 완료된 종란은 적합한 멸균처리 후 폐기함

4. HA 및 Real-time RT-PCR 검사

1) HA 검사

준비물 : HA 검사시료(요막액), V형 마이크로 플레이트, PBS, 1% 닭 적혈구액

검사방법

① V형 마이크로 플레이트의 각 well에 PBS 25㎕씩 분주

② 요막액 시료를 첫 번째 well에 각 25㎕씩 분주

※ 음성대조군을 위해 요막액 대신 PBS를 사용

③ 피펫을 이용하여 첫 번째 well에 있는 시료를 혼합 한 후 25㎕ 씩 혼합액을 다음 well로 옮겨 2진 희석을 수행

④ 2진 희석을 완료할 경우 마지막 well의 혼합액 25㎕는 버림

⑤ 1% 닭 적혈구액 25㎕를 모든 well에 분주한 뒤 플레이트를 잘 흔들어 주어 혼합시켜주고 상온에서 40분간 반응시킴

⑥ 40분 후 플레이트를 기울여 혈구응집 억제를 확인

< HA test 결과 >	[Potter and Oxford Br Med Bull. 1979]

⑦ 최종 결과판정은 플레이트를 45° 기울인 상태에서 혈구가 흘러내리지 않는 well을 기준으로 판정

2) Real-Time RT-PCR 검사

· 위 ‘Real-Time RT-PCR 진단‘ 내용과 동일하게 수행 함

Ⅲ	시료 수송방법

1. 양성반응 시료 통보

○ Real-time RT-PCR 검사 후 ‘AI 양성’으로 판정된 시료는 즉시 국립환경과학원에 유선으로 통보 후 공문 발송

- 국립환경과학원 환경보건연구과 생물안전연구팀

김용관 연구사 (032-560-7146 / *************)

손기동 전문위원 (032-560-7152 / *************)

- 공문을 발송 할 경우 아래 문서를 첨부하여 통보

· 신고자의 야생동물 질병진단 의뢰서

· 양성시료의 종란접종대장 기록 (종란접종 수행 시)

2. 시료 수송

○ AI 양성으로 확인된 스왑 및 조직시료 또는 요막액 시료는 냉장상태를 계속 유지하며 AI 양성시료 수송 매뉴얼[붙임 3]에 따라 시료를 포장하고 전문수송 위탁업체 또는 국립환경과학원에서 직접 수거 함

- AI 양성으로 확인된 개체의 원시료(폐사체), 검사에 사용된 조직 및 스왑(swab) 시료 등은 적합한 방법으로 멸균 처리하여 폐기

[붙임 3. AI 양성시료 수송 매뉴얼]

AI 양성시료 운송방법

야생동물 폐사체에서 AI 양성반응이 나타난 스왑 및 조직시료, 요막액 시료는 다음과 같이 포장하여 전문수송 위탁업체 또는 국립환경과학원에서 직접 수거 함

○ AI 양성시료 포장 및 수송방법

1. AI 양성시료를 포장 할 경우 개인 보호장구를 착용하고 수행함

※ 개인보호장구 : 실험복 또는 방역복, 마스크, 위생장갑

2. AI 양성 시료를 15 또는 50 ml conical tube에 담고 뚜껑을 파라필름 (Parafilm)으로 밀봉 (1차 포장)

3. 밀봉된 conical tube를 완충제와 흡수지로 감싸서 Y-bag 또는 비닐백에 담은 후 케이블타이 등으로 비닐백을 밀봉 (2차 포장)

※ 완충제와 흡수지는 신문지 등으로 대체 가능

4. 스티로폼 박스에 밀봉된 비닐백과 함께 아이스 팩, 완충제를 함께 넣은 후 밀봉 (3차 포장)

※ 국립환경과학원으로 운송되는 동안 냉장상태가 유지될 수 있도록 충분한 양의 아이스 팩 사용 (권장)

5. 포장된 시료를 전문수송 위탁업체 또는 국립환경과학원이 직접 수거 함

< AI 양성시료 포장방법 >

Ⅳ	고병원성 AI 발생시 대응방법

○ 국내 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI)가 발생 한 이후에는 접수된 야생동물 폐사체를 HPAI 감염 의심시료로 간주하여 AI 진단에 해당하는 전 과정을 생물안전 3등급시설 (BL-3)내 에서 수행

1. 시료채취

- HPAI 발생 이후 야생동물 폐사체를 수거 한 경우 밀봉된 상태에서 소독 후 BL-3 내로 이동 함

- BL-3 내에서 시료를 개봉하고 이후에는 HPAI 발생 전 과정과 동일하게 수행하여 시료를 채취 함

2. 조류인플루엔자 진단

- BL-3 내에서 채취된 시료는 HPAI 발생 전과 동일한 방법으로 전처리 한 후 Real-Time RT-PCR 또는 종란접종을 실시

종란접종의 경우 접종 후 5일 동안 매일 검란을 실시하며, 하루 2회 이상 검란을 수행하여 폐사 여부를 확인

종란접종 이후 5일 내 폐사한 종란은 즉시 HA 검사를 실시하며, Real-time RT-PCR 검사법을 통해 신속히 양성여부를 판정

※ BL-3 내에서 수집된 요막액을 BL-3 밖으로 이동해야 하는 경우, lysis buffer 등을 사용하여 반드시 불활성화 시킨 후 이동해야 함

3. 양성반응 시료 통보

○ AI 양성으로 판정된 시료는 확인된 즉시 국립환경과학원에 유선으로 통보 후 공문 발송

- 공문 발송 할 경우 과학원과 지자체에 동시 발송 함

- 국립환경과학원 환경보건연구과 생물안전연구팀

김용관 연구사 (032-560-7146 / *************)

손기동 전문위원 (032-560-7152 / *************)

- 공문을 발송 할 경우 아래 문서를 첨부하여 통보

· 신고자의 야생동물 질병진단 의뢰서

· 양성시료의 종란접종대장 기록

4. 시료 수송

○ AI 양성으로 확인된 시료는 [붙임. 3]을 참고하되, 각 단계별 포장하는 장소가 HPAI 발생 이전과 차이가 있음

- AI 양성 시료를 conical tube에 담아 완충제 및 흡수지로 감싼 후 비닐백에 넣는 것 (2차 포장) 까지 BL-3 내에서 수행

- 2차 포장까지 완료된 시료는 BL-3 내에서 소독제를 이용하여 소독을 실시하고, 10분 이상 자외선(UV-C)으로 조사한 후 BL-3 밖으로 이동 함

- BL-3 밖에서 아이스 팩과 완충제를 동봉하여 3차 포장을 완료 하고, 소독제로 추가 소독을 실시 후 전문수송 위탁업체 또는 국립환경과학원에서 직접 수거 함

Ⅴ	천연기념물 신고요령

○ 천연기념물로 등재된 야생동물 시료에 대한 질병검사를 실시 할 경우 문화재청에 ‘멸실신고’, ‘현상변경 신청’, ‘착수 및 완료 신고서’를 작성하여 신고해야 함

1. 천연기념물 멸실신고

1) 멸실신고서 작성

- 멸실신고는 야생동물 폐사체를 수거한 지자체에서 처리함

[멸실신고서 작성 예시]

■ 문화재보호법 시행규칙 [별지 제34호서식] <개정 2016.2.29.>
[ ]국가지정(등록)문화재 ([ v ]멸실 [ ]유실 [ ]도난 [ ]훼손) 신고서 [ ]국가지정문화재의 보호물ㆍ보호구역
	(앞쪽)
접수번호		접수일자		처리기간	2일
신고인	성 명 국립환경과학원	생년월일
주 소 인천광역시 서구 환경로42 국립환경과학원 환경보건연구과 바이오안전팀 (전화번호: 032-560-????/휴대전화: 010-3408-????)
문 화 재 의 명 칭 큰소쩍새	지정(등록)종류 및 번호 제 324-7 호
소 재 지 또 는 보 관 장 소 국립환경과학원	수량 1 점
보호물ㆍ보호구역 명칭
신고내용	사 고 연 월 일 2016.12.12
사 고 내 용 경기도 안성시 고삼면 월향리 251-7 폐사체 발견
사 고 경 위
조 치 내 용 AI 질병검사 관련 국립환경과학원 검사 의뢰
「문화재보호법」 제40조제1항제6호ㆍ제55조제6호, 같은 법 시행령 제23조ㆍ제33조 및 같은 법 시행규칙 제21조제4항ㆍ제38조제4호에 따라 위와 같이 신고합니다.
2016년 1 월 5 일
신고인	국립환경과학원(직인 생략)
문 화 재 청 장 귀하
첨부서류	ㅇ 관련 사진 첨부요망	수 수 료 없 음
210㎜×297㎜[백상지(80g/㎡) 또는 중질지(80g/㎡)]

2) 공문수행 (멸실신고서 첨부)

※ 국립환경과학원의 경우 인천광역시 서구청에서 업무대행

[멸실신고서 공문수행 예시]

3) 멸실신고 후 문화재청에서 멸실신고 완료통보

[멸실신고 완료통보 예시]

2. 천연기념물 현상변경 신청

1) 현상변경 허가신청서 작성

- 현상변경신청의 신고 주체는 의뢰한 지자체와 질병진단기관 간 협의를 통해 결정함. 아래 예시와 같이 현상변경 허가신청서 작성

[현상변경 신청서 작성 예시]

2) 연구 및 활용계획서 작성

- 현상변경신청을 할 경우 연구 및 활용계획서 작성

[연구 및 활용계획서 작성 예시]

3) 현상변경신청 공문수행

- 「현상변경 신청서」와 「부검 및 활용계획서」를 첨부하여 문화재청으로 공문 발송

[현상변경신청 공문수행 예시]

4) 문화재청의 현상변경 허가서 문서시행 후 부검수행

- 일반적으로 현상변경 허가서를 받은 이후 부검이 가능하나, AI 발생과 같은 긴급한 상황에서는 부검 후 현상변경 신청 가능

[현상변경신청 허가서 송부 예시]

3. 천연기념물 착수 및 완료 신청

1) 착수 및 완료 신청서 작성

- 착수 및 완료신고서(부검 종료 후 문화재청으로 최종신고 과정)의 신고 주체는 의뢰한 지자체와 질병진단기관 간 협의를 통해 결정함

[현상변경 신청서 작성 예시]

2) 착수 및 완료 신청서 공문수행

- 착수 및 완료신청서를 첨부하여 문화재청으로 공문 수행

[착수 및 완료 신청서 공문수행 예시]