식품의약품안전처 공고 제2014-177호

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안) 행정예고

2014. 6. 25

식품의약품안전처

식품의약품안전처 공고 제2014-177호

「건강기능식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전처고시 제2014-124호, 2014.6.5.)을 일부 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 「행정절차법」 제46조에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2014년 6월 25일

식품의약품안전처장

「건강기능식품의 기준 및 규격」일부 개정고시(안) 행정예고

1. 개정 이유
｢건강기능식품의 기준 및 규격｣의 기준․규격 적용을 명확하게 하고, 기능성 원료 중 오메가-3 지방산 함유 유지를 EPA 및 DHA 함유 유지로 명칭을 변경하며, 시험법을 개선하여 영업자 및 관계공무원 등의 이해를 도모하고 건강기능식품 산업 활성화에 기여 하고자 함.

2. 주요 내용

가. 기준 및 규격 적용의 명확화 [안 제 1, 6, 제 2, 1-1, 제 3, 2-14, 제 3, 2-16, 제 3, 2-20, 제 3, 2-24]

1) 기능성 원료별 기준 및 규격의 추가 등재 명확화

2) 건강기능식품에 사용할 수 없는 원료 대상 명확화

3) 기능성 원료인 오메가-3 지방산 함유 유지를 EPA 및 DHA 함유 유지로 변경함

4) 기준 및 규격 적용대상을 명확히 하여 안전하고 기능성이 확보되는 건강기능식품 유통을 도모

나. 시험법 개선[안 제 4.]

1) 분석 결과의 효율성을 높이기 위하여 시험법 제·개정

2) 히알루론산 등 7개성분 시험법 개선

3) 시험법을 효율적으로 제·개정하여 산업체의 건강기능식품 관리에 도움

3. 의견 제출

「건강기능식품의 기준 및 규격」 일부개정고시(안)에 대하여 의견이 있는 단체 또는 개인은 2014년 7월 25일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전처장(우편번호 : 363-700, 주소 : 충청북도 청원군 오송읍 오송생명2로 187 오송보건의료행정타운 식품의약품안전처, 참조 : 건강기능식품기준과, (전화) 043-719-2457, (팩스) 043-719-2450)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬․반 여부와 그 이유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자의 성명), 주소 및 전화번호

다. 기타 참고사항

식품의약품안전처 고시 제2014-000호

｢건강기능식품에 관한 법률｣ 제14조 및 제15조에 따른 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣(식품의약품안전처 고시 제2014-124호, 2014.6.5)을  다음과 같이 개정 고시합니다.

2014년 6월 00일

식품의약품안전처장

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

건강기능식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제 1, 6을 다음과 같이 한다.

1)「건강기능식품 기능성 원료 및 기준․규격 인정에 관한 규정」에 따라 인정된 기능성 원료는 다음의 어느 하나를 충족하면 「건강기능식품의 기준 및 규격」제 3. 개별 기준 및 규격에 추가로 등재할 수 있다. 다만 당해 영업자가 자료의 보호가 필요하다고 요청한 경우 그 타당성을 검토하여 기능성 원료로 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 날로부터 추가등재를 5년 이내에서 유예할 수 있다.

(1) 건강기능식품의 기능성 원료로 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 날로부터 3년이 경과하였거나 3개 이상의 영업자가 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 경우

(2)「건강기능식품에 관한 법률」제14조제2항의 규정에 의하여 인정받은 자가 등재를 요청하는 경우(다만 인정받은 자가 3명 이상인 경우에는 3분의 2가 건강기능식품공전에 등재를 요청하는 경우)

2)「건강기능식품 기능성 원료 및 기준·규격 인정에 관한 규정」제10조 제2항에 따른 기능성 내용 추가는 영업자가 인정받은 후 1년이 경과한 경우(다만, 인정받은 자가 건강기능식품공전에 등재를 요청하는 경우는 제외)

제 2, 1, 1-1, 3)을 다음과 같이 신설한다.

3) ｢야생생물 보호 및 관리에 관한 법률｣ 제2조제2호 및 제3호에서 정한 품목에 해당하는 것

제 3, 2, 2-14, 2), (2) 중 “실리마린(실리빈으로서)”을 “실리마린”으로 한다.

제 3, 2, 2-16 중 “오메가-3 지방산 함유 유지”를 “EPA 및 DHA 함유 유지”로 한다.

제 3, 2, 2-20, 2), (2) 중 “식물스테롤에스테르(식물스테롤에스테르를 원료로”를 “식물스테롤(식물스테롤을 원료로”으로 한다.

제 3, 2-24, 2) (3) 중 “cis-9 및 trans-11 공액리놀레산, trans-10 및 cis-12 공액리놀레산 함량(%)”을 "cis-9 및 trans-11 공액리놀레산과 trans-10 및 cis-12 공액리놀레산의 함량(%)”으로 한다.

[별표 4] 시험법 적용표를 다음과 같이 한다.

시험항목	적용규정	시험방법	비고
수분	식품의 기준 및 규격 (식품공전)	제10. 일반시험법 1.1.1 수분 ※ Ⅱ.2.7.1 로얄젤리는 1.1.1.3 칼피셔법에 따름
회분		제10. 일반시험법 1.1.2 회분
조지방		제10. 일반시험법 1.1.5.1 조지방
산가		제10. 일반시험법 1.1.5.3.1 산가
과산화물가		제10. 일반시험법 1.1.5.3.5 과산화물가
환원당		제10. 일반시험법 1.1.4.1.2 환원당
타르색소		제10. 일반시험법 2.4 착색료
납		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
카드뮴		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
총수은		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
총비소		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
세균수		제10. 일반시험법 3.5 세균수
대장균군		제10. 일반시험법 3.7 대장균군
대장균		제10. 일반시험법 3.8 대장균
살모넬라		제10. 일반시험법 3.11 살모넬라
세균발육		제10. 일반시험법 3.6 세균발육시험
테트라싸이클린클로르테트라싸이클린		제10. 일반시험법 5.3.49 옥시테트라싸이클린, 클로르테트라싸이클린, 테트라싸이클린, 독시싸이클린
총 아플라톡신		제10. 일반시험법 6.1.1 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)
포도당당량(D.E.)		제5. 식품별 기준 및 규격 6. 포도당 6) 시험방법 (1) 포도당당량(D.E.)
잔류용매 (초산에틸)	건강기능식품의 기준 및 규격 (건강기능식품공전)	제4. 건강기능식품 시험법 2, 2-5, 2-5-5 초산에틸
잔류용매 (이소프로필알콜)	식품첨가물의 기준 및 규격 (식품첨가물공전)	제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 108. 글루코만난
잔류용매		제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 80. 파프리카추출색소

제 4, 3, 3-4, 3-4-2, 5, 5.1을 다음과 같이 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35℃
이동상	헥산 : 이소프로판올(98 : 2)
검출기 파장	여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm
유량	0.5 mL/분

※ 정량시험을 위해 시험용액 1.0 mL에 토콜표준용액 1.0 mL를 가해(S) 이 용액의 10 μL를 분석한다. 또한 토코페롤동족체 각각에 대하여 각각 토코페롤 표준용액 1.0 mL를 취해 이에 토콜표준용액 1.0 mL를 가해 이 용액의 10 μL를 분석한다.

S : 시험용액에 함유된 토콜의 함량(mg)

제 4, 3, 3-4, 3-4-3 비타민 E(제3법)를 다음과 같이 신설한다.

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 일반 식품인 경우 시료 중 비타민 E를 수산화칼륨용액과 피로갈롤·에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 헥산/초산에틸(9:1)혼합용액으로 추출 후 감압 건조시켜 헥산을 가하여 녹여 형광검출기를 이용하는 방법과 유지식품의 경우 비누화조작을 생략하고 헥산으로 추출한 후 형광검출기를 이용하여 여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm에서 검출하고 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 갈색플라스크(100 mL)

2.1.5 갈색부피플라스크(25, 100 mL)

2.1.6 원심분리기

2.1.7 갈색원심분리관(50 mL)

2.1.8 감압농축기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD)

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 순상형 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 NH2) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 헥산과 초산에틸을 80 : 20으로 혼합하여 분당 1.0 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 α-Tocopherol((±)-α-Tocopherol; DL-all-rac-α-Tocopherol; Vitamin E)

분자식 : C29H50O2, 분자량 : 430.71, CAS No. : 10191-41-0

3.2 일반시약

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 피로갈롤(Pyrogallol)

3.2.3 증류수(Distilled water)

3.2.4 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.5 초산에틸(Ethyl acetate)

3.2.6 헥산(n-Hexane)

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 60% 수산화칼륨 용액

수산화칼륨 60 g을 증류수에 녹여 100 mL로 조제한다.

4.1.2 1% 염화나트륨 용액

염화나트륨 1 g을 증류수에 녹여 100 mL로 조제한다.

4.2 표준용액 제조

4.2.1 토코페롤동족체 표준용액

4.2.1.1 표준원액 : 토코페롤 동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)을 각각 50 mg씩 정밀히 취해 50 mL 갈색부피플라스크에 넣고 헥산으로 표선까지 채워 조제한다.

4.2.1.2 표준용액 : 각각 토코페롤 동족체 표준원액  5 mL씩 취하여 50 mL 갈색부피플라스크에 넣고 헥산으로 표선까지 채워 조제한 후 갈색유리병에 넣어 질소로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보관한다.

4.2.1.3 검량곡선표준용액 : 각각 표준원액을 적당량 취하여 갈색플라스크에 넣고 헥산으로 희석하여 1∼10 ug/mL이 되도록 조제한다. 보관 시에는 질소로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보관한다.

4.3 시험용액 제조(일반식품)

4.3.1 토코페롤로서 약 0.2 mg에 해당하는 시료를 정밀히 취하여 갈색 원심분리관에 넣는다.

4.3.2 1% 염화나트륨 용액 0.5 mL을 넣고 3% 피로갈롤 에탄올 용액 10 mL과 60% 수산화칼륨 용액 1 mL을 가하여 70℃ 수욕 중에 30분간 진탕하며 비누화한다.

4.3.3 이를 흐르는 물에 냉각하고 1% 염화나트륨 용액 22.5 mL을 가한 후 헥산․초산에틸(9 : 1) 혼합용액을 15 mL가하여 10분간 진탕한다.

4.3.4 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층을 갈색플라스크로 옮긴다.

4.3.5 하층에 헥산․초산에틸(9 : 1) 15 mL을 가하여 2회 반복 추출하여 상층액을 합한다.

4.3.6 회수한 상층액을 감압 농축한다.

4.3.7 위의 잔류물에 일정량의 헥산을 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

4.4 시험용액 제조(유지식품)

시료가 유지인 경우에는 비누화 조작을 생략하고, 고속액체크로마토그래프에 직접 주입할 수 있다.

4.4.1 유지 약 1 g을 정밀히 취해 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.4.2 헥산을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.4.3 위 용액의 일정량을 취해 헥산으로 희석한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35℃
이동상	헥산 : 초산에틸(80 : 20)
검출기 파장	여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm
유량	1.0 mL/분

5.2 계산

α, β, γ, δ-토코페롤의 함량(mg/100 g)	=	C	×	(a × b)	×	100
				S		1,000

C：시험용액 중의 α, β, γ, δ-토코페롤의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수

S : 시료 채취량(g)

제 4, 3, 3-26, 3-26-1을 다음과 같이 한다.

1. 시험방법의 요약

건조된 시료 두 개를 준비하고 이를 내열성 α-아밀라아제, 프로테아제, 아밀로글루코시다제 효소로 연속적으로 분해하여 전분과 단백질을 제거한다. 이때 10% 이상의 지방을 함유한 식품은 건조 전에 지방을 제거하여 시험한다. 총 식이섬유(TDF) 정량은 효소분해물에 녹아 있는 식이섬유를 에탄올로 처리하여 침전시켜 여과하고 에탄올과 아세톤으로 세척한 후, 건조하여 그 무게를 확인한다. 물불용성 식이섬유(IDF)는 효소분해물을 여과하여 잔사를 따뜻한 물로 세척하고 그 무게를 확인하여 정량한다. 수용성식이섬유(SDF)는 IDF의 전처리과정에서 얻은 여과액과 세척액을 합하여 에탄올로 침전시킨 후 여과하여 잔류물을 건조하고 무게를 확인하여 정량한다. 총 식이섬유, 물불용성 및 수용성식이섬유 함량계산 시 잔사의 무게 중 단백질 및 회분량은 보정해준다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 비이커 : 400 또는 600 mL Tall-form

2.1.2 유리여과기 : 기공 40～60 μm(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 대기 중 방치하여 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

2.1.3 진공장치 : 조절장치를 갖춘 진공펌프나 아스피레이터, 1L 용량의 여과용 가지달린 플라스크 및 여과용 플라스크에 사용하는 고무 아답터

2.1.4 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온 및 온도의 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것

2.1.5 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것

2.1.6 회화로 : 525±5℃ 유지할 수 있는 것

2.1.7 오븐 : 105℃와 130±3℃ 유지할 수 있는 것

2.1.8 데시케이터 : 실리카겔이나 이와 동등한 건조제가 있는 것

건조제는 필요 시 130℃에서 하룻밤 동안 건조하여 사용한다.

2.1.9 pH meter : 온도 보정이 되고 pH 4, 7, 10 버퍼용액으로 표준화 된 것

2.1.10 피펫 : 일회용 팁이 사용가능한 것으로 용량 100～300 uL 및 5 mL

2.1.11 디스펜서 : 15±0.5 mL용 3개(78% ethanol, 95% ethanol, acetone용), 40±0.5 mL용 1개(버퍼용)

2.1.12 자석 교반기 및 마그네틱바

3. 표준물질 및 일반시약

3.2 시액의 제조

3.2.1 에탄올 수용액

(1) 85% : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 895 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

(2) 78% : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

3.2.2 내열성 α-아밀라아제 용액 : 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3306 또는 이와 동등한 것)

※ (1) 가용성 전분을 기질로 하는 Nelson/Somogyi reducing sugar 방법에 기초하는 것 : 10,000±1,000 units/mL(1 unit: pH 6.5, 40℃에서 1분당 1 μmole reducing sugar equivalents를 만드는 데 필요한 효소의 양)

※ (2) 내열성 α-글루코시다제의 존재 시 기질로 p-nitrophenyl - maltosaccharide를 사용하는 Ceralpha방법에 기초한 것 : 3,000±300 Ceralpha units/mL(1 unit: pH 6.5, 40℃에서 1분당 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양)

3.2.3 프로테아제 효소용액: 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 MES/TRIS 완충액으로 희석하여 50 mg/mL로 사용 시 조제한다(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것).

※ (1) Casein assay: 300～400 units/mL(1 unit: pH 8.0, 40℃에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양) ; 7～15 units/mg(1 unit: pH 7.5, 37℃에서 casein으로부터 1분당 1.0 μmole tyrosine에 해당하는 색(Folin-Ciocalteau reagent)을 내는데 필요한 효소의 양)

(2) Azo-casein assay : 300～400 units/mL(1 unit endo-peptidase activity: pH 8.0, 40℃에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양)

3.2.4 아밀로글루코시다제 용액 : 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

※ (1) Starch/glucose oxidase-peroxidase 방법 : 2,000～3,300 units/mL(1 unit: pH 4.5, 40℃에서 1분당 1 μmole 포도당을  만드는 데 필요한 효소의 양)

(2) PNPBM (p-nitophenyl β-maltosidase) 방법 : 130～200 units/mL(1 unit: β-글루코시다제가 과량 존재할 때, 40℃에서 1분당 p-nitrophenyl β-maltosidase가 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양).

3.2.5 규조토(Diatomaceous earth) : 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, 산세척 또는 그와 동등한 것)

3.2.6 세척용액 : 실험실용 액체 계면활성 세정제(International products사의 Micro 혹은 그와 동등한 것)를 2% 수용액으로 조제한다.

3.2.7 MES : 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid(Sigma사 Catalog No. M-8250 또는 이와 동등한 것)

3.2.8 TRIS : Tris(hydroxymethyl) aminomethane(Sigma사 Catalog No. T-1503 또는 이와 동등한 것)

3.2.9 MES-TRIS 완충용액(0.05 M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2) : MES 19.52 g과 TRIS 12.2 g을 물 1.7 L에 녹인 후 6 N 수산화나트륨용액을 가하여 pH 8.2로 조절한 후, 물을 가하여 2 L가 되게 조제한다(24℃에서 pH 8.2로 조절하는 것이 중요하다. 만약 버퍼용액의 온도가 20℃이면 pH 8.3으로 조절하고, 28℃이면 pH 8.1로 조절한다).

3.2.10 염산용액(0.561 N) : 1 L 정용 플라스크에 물 약 700 mL를  넣고 6 N HCl 93.5 mL을 혼합한 후 증류수로 표선까지 채워 조제한다.

4. 시험과정

4.1 시험용액의 제조

4.1.1 시료 균질화

건조된 시료의 총 식이섬유를 확인하기 위해서 시료를 균질화한 후, 70℃ 진공오븐에서 하룻밤 동안 건조시킨다. 시료를 데시케이터에서 방냉하고 0.3～0.5 mm mesh가 되도록 건식 분쇄한다. 열처리를 할 수 없는 시료의 경우 분쇄하기 전에 냉동 건조한다. 지방함량이 높다면(10% 이상) 분쇄하기 전에 석유에테르로 탈지한다(시료 1 g당 25 mL 씩 3번 처리). 지방제거로 인한 무게 손실을 기록하고 이에 대한 총 식이섬유 함량(%)을 보정한다. 분석 전까지 건조-분쇄된 시료는 마개가 있는 병에 담아 데시케이터에서 보관한다(만약 시료의 지방함량을 모른다면, 식이섬유를 측정하기 전에 탈지한다). 당 함량이 높은 제품은 식이섬유 측정 전에 85% 에탄올(10 mL/g)로 2～3회 추출한 다음 상등액을 제거하고 40℃에서 하룻밤 동안 건조한다.

4.1.2 효소분해

4개의 400 mL(또는 600 mL) tall-form 비이커에 시료 1.000± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  MES-TRIS 완충용액 40 mL씩 가하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산될 때까지 자석 교반하여 혼합한다. 저속으로 혼합하면서, 내열성 α-아밀라아제 용액 50 μL을 첨가한다. 비이커를 알루미늄박으로 덮은 후 95∼100℃ 수욕에서 15분 동안 계속 교반하면서 반응한다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비이커를 꺼내어 60℃로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비이커의 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비이커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 프로테아제 효소용액 100 μL을 각 비이커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비이커를 덮고 60±1℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 알루미늄박을 제거한 후 비이커를 잘 교반하면서 0.561 N HCl 5 mL을 넣어준다. 60℃에서 1 N NaOH, 1 N HCl를 사용하여 용액을 pH 4.0～4.7로 조정한다(※ 참고 : pH는 낮은 온도에서 올라가기 때문에 60℃에서 pH를 조정하고 확인하는 것이 중요하다. 대부분의 곡류, 채소 시료의 경우, pH 조정이 없이도 pH조건을 만족할 수 있으므로 이전에 확인된 시료의 경우, pH 조정 과정을 생략할 수 있다. 단, 공시험의 pH를 예비단계로 확인하고 만약 공시험의 pH가 올바른 범위를 벗어난다면, 반드시 시료의 pH를 점검한다). 비이커를 교반하면서 아미노글루코시다제 용액 300 μL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60 ± 1℃ 수욕에서 교반하면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

4.2 총 식이섬유(TDF) 함량 측정

4.2.1 실온 기준 225 mL 95% 에탄올을 60℃에서 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비이커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 1시간 침전시킨다. ☆미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에  78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인 여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비이커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 78% 에탄올, 95% 에탄올, 아세톤 순으로 각각 15 mL씩 2회 잔류물을 씻는다. ★105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 동안 건조시키고, 데시케이터에서 1시간 동안 방냉하여 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

4.3 물불용성 식이섬유(IDF) 측정

4.3.1 미리 규조토를 넣어 항량하여 준비한 유리여과기에 물 3 mL을 가하여 규조토를 적시고 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층을 고르게 한다. 이에 시험용액 조제에서 얻어진 효소분해물을 유리여과기를 통해 여과용 플라스크로 여과한다. 비이커를 세척하면서 잔류물을  70℃ 물 10 mL로 2회 세척한다. 여액과 물 세척액을 합치고, 미리 무게를 칭량한 600 mL 비이커로 옮겨 9) 수용성 식이섬유 측정에 사용한다. 잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15 mL씩 2회 세척한다(주의: 잔류물의 세척을 즉시 하지 않을 경우, IDF 값이 높아질 수 있다). 7) 총식이섬유 함량 측정 과정의 ★ 이하에 따라 IDF의 무게를 계산한다.

4.4 수용성 식이섬유(SDF) 측정

4.4.1 물불용성 식이섬유 측정에서 600 mL 비이커로 옮긴 여액과 물 세척액의 무게를 확인하여 부피를 확인하고 미리 60℃로 가열된 95% 에탄올을 측정한 부피의 4배량을 가한다. 이때 60℃ 에탄올의 일부를 이용하여 여과용 플라스크에 남은 여액과 물 세척액을 세척한다. 여과액과 물 세척액에 에탄올을 4배량 가하기 위한 방법으로 물을 첨가하여 여과액과 물 세척액의 무게를 80 g으로 맞추고, 60℃의 95% 에탄올 320 mL을 가할 수도 있다. 그 후, 상온에서 1시간 침전시킨 후, 7) 총 식이섬유 함량 측정 중 ☆이하에 따라 SDF의 함량을 측정한다.

5. 계산

5.1 계산

※ 총 식이섬유 함량은 7) 총 식이섬유(TDF) 함량 측정을 독립적으로 수행하여 결정하거나 8) 물불용성 식이섬유(IDF) 측정 및 9) 수용성 식이섬유(SDF) 측정에서 구한 IDF와 SDF의 합으로 결정할 수 있다.

가) 공시험 함량 (B, mg) 측정:

B = [(B1R + B2R) / 2] - PB - AB

B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사의 무게(mg)

PB: 공시험(B1)의 단백질 무게(mg)

AB: 공시험(B2)의 회분 무게(mg)

나) 식이섬유 함량(DF, g/100g) 측정:

[eqn: DF= {{[M1R+M2R]} over {2} -P-A-B} over {{(M1`+M2)} over {2}} TIMES 100]

M1R, M2R : 검체 2반복의 잔사 무게(mg)

P : 잔사(M1R) 중 단백질 무게(mg)

A : 잔사(M2R) 중 회분 무게(mg)

B : 공시험 함량(mg)

M1, M2: 검체의 무게(mg)

제 4, 3, 3-26, 3-26-2를 다음과 같이 한다.

1. 시험방법의 요약

난소화성 말토덱스트린(RMD) 등을 함유한 식품에 인산완충액을 이용한 효소-중량법을 적용하여 에탄올에 의해 침전되는 고분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(HMWSDF)를 확인하고 에탄올에 녹는 저분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(LMWSDF)를 탈염하여 농축한 후, 액체크로마토그래피로 확인하는 방법이다. 이 방법에서 총 식이섬유는 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF와 액체크로마토그래피로 확인한 LMWSDF의 합으로 계산되어진다. 즉 효소-중량법으로 구한 식이섬유의 함량에 알코올에 녹는 수용성 식이섬유의 함량을 합하여 총 식이섬유의 함량으로 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것

2.1.2 비이커 : 500 mL Tall-form

2.1.3 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온하여 온도 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것

2.1.4 유리여과기 : 기공 40～60 μm(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

2.1.5 유리 또는 플라스틱 칼럼관: 이온교환수지를 채우기 위한 것으로 40∼70 cm × 15 mm 내경의 칼럼관

2.1.6 유리막대 : 20 cm 길이로 끝을 열처리한 것

2.1.7 일회용 주사기 : 10 mL

2.1.8 파스퇴르 피펫, 10 mL 정용피펫

2.1.9 저울 : 4,000 g 용량

2.1.10 테프론 막대 : 비이커의 침전물을 모을 수 있는 것

2.1.11 용량플라스크 : 10, 50, 250 및 1,000 mL

2.1.12 감압농축기

2.2 분석장비

2.2.1 고소액체크로마토그래프

2.2.2 시차굴절계(Refractive Index Detector)

2.2.3 칼럼오븐

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 액체크로마토그래피 머무름 시간 확인용 표준물질: 저분자의 난소화성 말토덱스트린에 해당하는 올리고당[DP(Degree of polymerization)≥3]을 포함한 DE(Dextrose equivalent) 25 또는 16.5～19.5의 말토덱스트린(Sigma사 419699 또는 이와 동등한 것)

3.1.2 Glycerol

분자식 : C3H8O3, 분자량 : 92.09, CAS No. : 56-81-5

3.2 일반시약

3.2.1 증류수 : 3차 증류수

3.2.2 에탄올 : 95% Technical grade

3.2.3 에탄올 수용액(78%)

1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

3.2.4 인산수소나트륨(Na2HPO4) 및 인산이수소나트륨(NaH2PO4)

3.2.5 내열성 α-아밀라아제 용액: Termamyl 120 또는 이와 동등한 것, 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3403 또는 이와 동등한 것)

3.2.6 프로테아제 효소용액: 1.1.4.3. 가. 4)시약 및 시액 라)의 효소분해능을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 인산 완충용액으로 희석하여 10 mg/mL로 사용 시 조제한다(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것)

3.2.7 아밀로글루코시다제 용액 : 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

3.2.8 규조토(Diatomaceous earth): 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, acid washed 또는 이와 동등한 것)

3.2.9 각 시료의 탈염을 위한 이온교환수지

(1) m-1 : 25 g Amberlite IRA-67(OH-type) 또는 이와 동등한 것

(2) m-2 : 25 g Amberlite 200 CT(HG)H(H-type) 또는 이와 동등한 것

3.2.10 황산암모늄

3.2.11 덱스트로즈 : 액체크로마토그래피용, 순도 99.5% 이상

3.3 시액의 제조

3.3.1 인산 완충용액(0.08M, pH 6.0)

무수 인산수소나트륨 1.4 g(또는 2수화물 1.753 g)과 9.68 g 인산이수소나트륨·1수화물(또는 2수화물 10.94 g)을 700 mL 증류수에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다. 이때 pH를 확인한다.

3.3.2 각 시료의 탈염을 위한 이온교환수지

(1) m-1 : 25 g Amberlite IRA-67(OH-type) 또는 이와 동등한 것

(2) m-2 : 25 g Amberlite 200 CT(HG)H(H-type) 또는 이와 동등한 것

각 시험 용액의 분석을 위해서 유리칼럼에 상기 2종의 수지를 잘 혼합하여 충진 한다.

․총 이온교환능 : 1.74 meq/mL

․유효 이온교환능(R-H 교환능) : 1.6 meq/mL(min.)

․상기 2종의 수지를 혼합하여 충진하기 전 각 수지를 증류수로 세척하고 세척액의 pH가 m-1은 7～8.8, m-2는 4～7의 값이 되도록 한다.

※ Amberlite 200 CT(HG)H가 없을 경우, Amberlite 200 (Na-type) 또는 Amberlite 200CT를 'H-type'으로 전환하여 사용한다. 이를 위해 Amberlite 200(Na-type) 600 mL(500 g)을 유리 또는 플라스틱 칼럼관(100 cm × 40 mm id)에 채우고 2배 부피의 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하고 2배 부피의 10% 염산용액(1→3 w/w)을 재차 60 mL/min의 속도로 흘려준 후 수지의 3배 부피에 해당하는 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하여 염산을 제거한다. 3～6배의 부피에 해당하는 증류수를 120 mL/min의 속도로 재차 세척하고 세척액의 pH가 4～7인지 확인하여 염산용액의 세척이 제대로 이루어졌는지 확인하여 사용한다.

3.3.3 수산화나트륨 수용액(0.274 N)

NaOH 11 g을 증류수 약 700 mL에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

3.3.4 염산용액(0.325 N)

1 L 정용 플라스크에 1 N HCl 325 mL을 넣고 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

3.3.5 글리세롤 표준용액(10 mg/mL)

비이커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 1L 정용플라스크로 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

3.3.6 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액(100 mg/mL)

비이커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 100 mL 정용플라스크에 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

4. 시험과정

4.1 시료 균질화

4.1.1 제 10, 1, 1.1, 1.1.4, 1.1.4.3. 식이섬유 가. 효소-중량법 6) 시험용액 조제 가)와 같이 준비한다. 당 함량이 높은 시료의 경우, LMWSDF의 손실을 고려하여 85% 에탄올 세척과정은 생략한다.

4.2 효소분해

4.2.1 4개의 500 mL tall-form 비이커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  인산 완충용액 50 mL씩 가하고 초음파를 이용하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산시킨다. 내열성 α-아밀라아제 용액 100 μL을 첨가한다. 비이커를 알루미늄박으로 덮은 후 95℃ 수욕에서 30분 동안 계속 진탕하면서 반응시킨다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비이커를 꺼내어 실온으로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비이커에 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비이커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 0.275 N 수산화나트륨용액으로 pH를 7.5±0.1로 조정한 후, 프로테아제 효소용액 0.5 mL를 각 비이커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비이커를 덮고 60℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 실온으로 용액을 식힌 후, 알루미늄박을 제거한 후 비이커를 잘 교반해주면서 0.325 N HCl로 용액의 pH를 4.5±0.2로 조정한다. 비이커를 교반해주면서 아미노글루코시다제 용액 0.3 mL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60℃ 수욕에서 지속적으로 흔들면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

4.3 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF의 함량 측정

4.3.1 60℃로 가열한 95% 에탄올을  60℃ 수욕 상의 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피의 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비이커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 하룻밤 침전시킨다. 미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에 있는 78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인 여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약 스푼을 이용하여 비이커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 20 mL 78% 에탄올 3회, 10 mL 95% 에탄올로 2회, 10 mL 아세톤으로 2회씩 잔류물을 씻어낸다. 105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 건조시키고, 유리여과기를 데시케이터에서 1시간 동안 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

4.4 여액 회수 및 탈염

4.4.1 4.3의 여액을 감압농축기로 농축하여 완전 건고하고 잔류물을 소량의 물로 녹인 후, 이를 50 mL 정용플라스크에 정량적으로 옮긴다. 이에 글리세롤 표준용액 10 mL을 넣고 증류수로 표선까지 채워 50 mL로 조제한다. 이를 Amberlite IRA-67(m-1) 및 Amberlite 200CT(HG)H(m-2) 각 25 g을 완전히 혼합하여 채운 유리칼럼(75 cm × 15 mm id)에 통과시키고 이후, 250 mL 증류수로 칼럼을 통해 세척하며 추출한다. 이때 유속은 0.8 mL/min으로 조정한다. 이온교환 칼럼을 통과한 초기 용출액부터 250 mL를 모아 정량적으로  500 mL 둥근 플라스크에 옮기고 완전 건고될 때 까지 감압 농축한다. 이를 10 mL 정용플라스크로 증류수를 이용하여 정량적으로 옮겨 10 mL로 조제한 후 10 mL 일회용 주사기에 옮겨 0.2 μm 맴브레인 필터로 여과하여 액체크로마토그래피용 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 시험조작

5.1.1 액체크로마토그래프의 측정조건

- 분석칼럼 : TSK-GEL G2500PWX L, 7.8 mm id × 30 cm를 연속하여 2개를 연결한 것 또는 이와 동등한 것

- 가드 칼럼 : TSK guard column PWXL, 6.0 mm id × 4 cm 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도 : 80℃

- 이동상 : 증류수

- 유속 : 0.5 mL/min

- 주입량 : 20 μL

- 검출기 : 시차굴절계검출기(RI), 40℃ 유지

5.1.2 RMD와 액체크로마토그래피 반응이 동등한 덱스트로즈로 반응계수 결정

RMD의 RI 검출기의 반응에 대한 평가와 표준화를 위해 글리세롤 표준물질을 사용한다. LC 분석에서 RI 검출기에서 얻은 RMD의  피크면적은 덱스트로즈와 동등하며 내부표준물질인 글리세롤의 피크면적과 덱스트로즈의 농도에 따른 피크면적을 비교한다. 이렇게 작성된 검량곡선으로부터 시험용액 중 RMD의 함량을 계산하는데 사용할 반응계수를 결정한다.

동량의 글리세롤과 3개 농도 수준으로 덱스트로즈를 100 mL 정용플라스크에 각각 넣은 3개의 용액을 준비한다. 이를 위해 0.5, 1.0, 2.0 g의 덱스트로즈를 3개의 구분된 100 mL 정용플라스크에 정확히 칭량하여 넣고 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액 10 mL을 각 정용 플라스크에 첨가한 후 증류수를 채워 100 mL로 조제한다. 조제된 3개의 표준용액 20 μL를 액체크로마토그래피에 주입하여 각 크로마토그래피에서 덱스트로즈와 글리세롤의 피크면적을 확인하여 글리세롤의 피크면적에 대한 덱스트로즈 피크면적 비(y-축)와 글리세롤 함량에 대한 덱스트로즈 함량 비(x-축)을 비교하여 얻어진 기울기의 역수로부터 아래의 식과 같이 반응계수를 구한다.

반응계수(Rf) = 1/[(PA-dex/PA-gly) × (Wt-gly/Wt-dex)]

PA-dex : 덱스트로즈 피크면적

PA-gly : 글리세롤 피크면적

Wt-dex : 표준용액 중 덱스트로즈 함량

Wt-gly : 표준용액 중 글리세롤 함량

5.1.3 액체크로마토그래피의 크로마토그램

그림 1. 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램

5.2 식이섬유 함량 계산

※ 총 식이섬유 함량(TDF)은 %(IDF+HMWSDF)와 LMWSDF의 평균 함량(%ALMWSDF)을 합하여 계산한다.

5.2.1 (IDF + HMWSDF)의 함량 계산

(1) 공시험 함량(B, mg) 측정:

B = [(B1R +B2R) / 2] - PB - AB

B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사의 무게(mg)

PB: 공시험(B1)의 단백질 무게(mg)

AB: 공시험(B2)의 회분 무게(mg)

5.2.2 (IDF + HMWSDF) 평균 함량(g/100g) 측정:

[eqn: %(IDF+HMWSDF)= {{[M1R+M2R]} over {2} -P-A-B} over {{(M1`+M2)} over {2}} ` TIMES `100]

M1R, M2R: 검체 2반복의 잔사 무게(mg)

P: 잔사(M1R) 중 단백질 무게(mg)

A: 잔사(M2R) 중 회분 무게(mg)

B: 공시험 함량(mg)

M1, M2: 검체의 무게(mg)

5.2.3 LMWSDF의 평균 함량

5.2.3.1 LMWSDF(mg) 측정:

LMWSDF	=	PAS_LMWSDF × WtS_gly × Rf
		PAS_gly

PAS_LMWSDF : 시험용액 중 LMWSDF(DP≥3)의 피크면적

PAS_gly : 시험용액 중 글리세롤의 피크면적

WtS_gly : 시험용액에 첨가한 글리세롤의 무게(mg)

Rf : 덱스트로즈-글리세롤 반응계수

5.2.3.2 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100g) 측정

%LMWSDF	=	LMWSDF × 100
		SW

SW : 시료의 무게(mg)

5.2.3.3 LMWSDF의 평균 함량(g/100g)

%ALMWSDF	=	%LMWSDF + %LMWSDF'
		2

%LMWSDF, %LMWSDF' : 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100 g)

제 4, 3, 3-73 폴리감마글루탐산을 다음과 같이 신설한다.

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 폴리감마글루탐산을 산분해한 후 아미노산 자동분석기를 이용하여 분석하는 방법으로 570 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 아미노산 자동분석기

2.2.2 이온 교환 칼럼으로 HR NA 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 200 mm, 유리아미노산 분석용) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

완충액, 발색시약의 유무, 칼럼항온조의 온도를 점검하고, 자동완충액 전환기구 및 정유량 펌프, 유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실시한다.

2.3.1 아미노산 자동분석기 관련 시약

2.3.1.1 닌히드린시약(Ninhydrin reagent, 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

2.3.1.2 구연산리튬완충액(Lithium citrate buffer, 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

2.3.1.3 완충액(기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 폴리감마글루탐산(Poly-[gamma]-glutamic acid)

분자식 : C15H21N3O9X2, 분자량 : 387.34, CAS No. : 84960-48-5

3.2 일반시약

3.2.1 염산(Hydrochloric acid)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 메탄올(Methanol)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질 폴리감마글루탐산 10 mg을 정밀히 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 증류수를 넣어 표선까지 맞추어 표준원액으로 한다.

4.1.3 표준원액을 0.02N 염산용액으로 적정농도로 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 100 mg을 정밀히 칭량하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.2 적당량의 증류수를 넣고 잘 흔들어 녹인다

4.2.3 10분간 초음파로 추출한다.

4.2.4 증류수로 10 mL가 되게 정용한다(A).

4.2.5 (A)액 0.5 mL를 취하여 6N 염산 10 mL를 가한 후 110℃에서 24시간 가수분해한다.

4.2.6 위의 용액을 50 mL 부피플라스크에 옮겨 증류수로 정용한 다음 0.02 N 염산용액으로 10배 희석하여 시험용액으로 한다.

4.2.7 시험용액을 아미노산 자동분석기로 분석하여 총 글루탐산 함량(%)을 구한다.

4.2.8 산으로 가수분해 하지 않은 (A)액은 0.02 N 염산용액으로 10배 희석하여 아미노산 자동분석기로 분석하여 유리 글루탐산 함량(%)을 구한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 아미노산 자동분석기조건(예)

항목	조건
주입량	20 uL
칼럼온도	38∼78℃
흡광검출기 파장	570 nm
완충액	0.35 mL/min
반응액	닌히드린 시약 : 0.30 mL/min
반응기온도	135℃

5.2 계산

5.2.1 폴리감마글루탐산 함량(mg/g) = (총 글루탐산 함량 × 0.88) - 유리 글루탐산 함량

* 총 글루탐산 함량(mg/g)= (H × V × D)/(S × 1,000)

H : 가수분해한 시험용액의 총 글루탐산 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

D : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

* 유리 글루탐산 함량(mg/g) = (C × V × D)/(S × 1,000)

C : (A)액의 유리 글루탐산 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

D : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

* 0.88 = 129 (폴리글루탐산중의 글루탐산 잔기의 분자량)/147  (글루탐산 분자량)

제 4, 3, 3-74 히알루론산을 다음과 같이 신설한다.

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료로부터 추출한 히알루론산을 콘드로이티나아제 ABC를 이용하여 특이적으로 분해시켜 얻은 이당류를 액체크로마토그래프를 사용하여 분석하는 방법이다. 음이온을 가진 이들 분해산물을 음이온교환수지 칼럼을 이용하여 232 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

2.1.6 교반기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 강염기성의 암모늄이온 교환수지로 코팅된 실리카겔), Hypersil GOLD SAX 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 0.05M NaCl(pH 3.5)을 분당 1.0 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Hyaluronic acid sodium salt(Poly(β-glucuronic acid-[1→3]-β-N-acetylglucosamine -[1→4]), alternating)

분자식 : (C14H21NaNO11)n, 분자량 : 401.3, CAS No. :  9067-32-7

3.2 일반시약

3.2.1 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC)

3.2.2 트리스염(Tris base)

3.2.3 아세트산나트륨(Sodium acetate)

3.2.4 염산(Hydrochloric acid)

3.2.5 증류수(Distilled water)

3.3 시액의 제조

3.3.1 33 mM Tris-HCl 완충용액 제조

트리스염 3.99 g과 아세트산나트륨 2.7 g을 각각 취하여 900 mL 증류수에 녹인 후 염산을 이용하여 pH 8.0으로 조절한 후 1 L로 한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질을 정밀하게 칭량하고 33 mM Tris-HCl 완충용액에 희석하고 60℃ 수욕상에서 완전히 녹인 것을 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 33 mM Tris-HCl 완충용액을 이용하여 적절히 희석한 용액을 표준용액으로 한다.

4.1.3 표준용액 50 uL에 0.002 unit/uL 콘드로이티나아제 ABC 50 uL와 33 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액 400 uL를 넣고 37℃에서 3시간 반응시킨다.

4.1.4 반응이 완료되면 100℃에서 5분간 가열하고 위의 용액을 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 히알루론산으로서 0.5∼5 mg이 함유되도록 적당량의 시료를 칭량하여 50 mL 부피플라스크 넣고 33 mM Tris-HCl 완충용액으로 정용한 후 혼합한다.

4.2.2 마그네틱 바를 넣고 60℃에서 90분간 강하게 추출 후 실온에 식힌다.

4.2.3 시료추출액 50 uL에 0.002 unit/uL 콘드로이티나아제 ABC  50 uL와 33 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액 400 uL를 넣고 37℃에서 3시간 반응시킨다.

4.2.4 반응이 완료되면 100℃에서 5분간 가열하고 용액을 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 uL
칼럼온도	40℃
이동상	0.05 M NaCl(pH 3.5)
검출기 파장	232 nm
유량	1.0 mL/min

5.2 계산

5.2.1 히알루론산 표준용액에서 얻은 히알루론산의 피크면적으로 검량선을 작성하고, 검량선 식을 이용하여 시험용액 중의 히알루론산의 농도를 구한 후 아래 식을 이용하여 히알루론산 함량을 계산한다.

히알루론산의 함량 (mg/g) =	A × B × C	×	378.3
	D × 1,000		401.3

A : 시험용액의 전량(mL)

B : 희석배수

C : 시험용액중의 히알루론산의 농도(μg/mL)

D : 시료 채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

378.3 : 히알루론산 이당류의 분자량

401.3 : 히알루론산 나트륨 이당류의 분자량

제 4, 3, 3-75 로사빈을 다음과 같이 신설한다.

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 로사빈을 메탄올 용액으로 초음파로 추출 한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 250 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 증류수와 아세토니트릴을 80 : 20으로 혼합하여 분당 1.0 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 로사빈(Rosavin)

분자식 : C20H28O10, 분자량 : 428.43, CAS No. : 84954-92-7

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile)

3.2.3 증류수(Distilled water)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질 로사빈 10 mg을 정밀히 칭량하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 메탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.1.3 위의 표준원액을 메탄올을 이용하여 적정농도로 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 100 mg을 정밀히 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 메탄올을 가하여 녹인다.

4.2.2 10분 동안 초음파로 추출 후 실온에서 냉각하여 메탄올로 정용한다.

4.2.3 위의 용액을 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	30℃
이동상	A : Distilled water B : Acetonitrile
검출기 파장	250 nm
유량	1.0 mL/min

표 2. 고속액체크로마토그래프 이동상 조성(예)

분	이동상(%)
	A(Distilled water)	B(Acetonitrile)
0	80	20
15	80	20
20	30	70
25	30	70
30	80	20
40	80	20

5.2 계산

5.2.1. 로사빈 함량(mg/g) = C × (a × b)/S × (1/1,000)

C : 시험용액 중의 로사빈의 농도(ug/mL)

S : 시료 채취량(g)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

제 4, 3, 3-76 안토시아노사이드를 다음과 같이 신설한다.

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 안토시아노사이드를 염산을 이용하여 안토시아니딘으로 분해한 후 분광광도기로 분석하는 방법으로 540 nm의 파장으로 흡광도를 구하여 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 자외분광광도계

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 안토시아니딘의 함량이 알려진 바키늄미르틸루스엑스

3.2 일반시약

3.2.1 무수에탄올(Ethanol, anhydrous)

3.2.2 염산(Hydrochloric acid)

3.2.3 증류수(Distilled water)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 안토시아니딘의 함량이 알려진 바키늄미르틸루스엑스 약 20 mg을 정밀히 칭량하여 시험용액과 같이 조작하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 20 mg(안토시아니딘으로서)을 정밀히 칭량하여 무수에탄올·1.5 mol/L 염산혼합액(17:3)을 넣어 녹인 후 200 mL 부피플라스크에 정용한다.

4.2.2 이 액 5 mL를 취하여 무수에탄올·1.5 mol/L 염산혼합액(17:3)을 넣어 50 mL로 정용한 다음 여과하여 처음 여액 20 mL는 버리고 다음 여액을 시험용액으로 한다.

4.2.3 무수에탄올·1.5 mol/L 염산혼합액(17:3)을 대조액으로 하여 파장 540 nm에서 시험용액 및 표준용액의 흡광도 AT 및 AS를 측정한다.

5. 계산

5.1 계산

5.1.1. 총 안토시아노사이드의 함량(mg/g) =

표준품의 안토시아니딘 양(mg)	×	AT	×	1.475	×	1	×	1
		AS				S		1,000

AT: 시험용액의 흡광도

AS: 표준용액의 흡광도

S : 시료 채취량 (mg)

1.475: 안토시아니딘의 안토시아노사이드 전환계수

1/1,000 : 단위 환산 계수

제 4, 3, 3-77 알리인을 다음과 같이 신설한다.

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 알리인의 함량을 80% 메탄올 용액으로 초음파로 추출 한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 208 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 3.0 mm, 길이 150 mm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 A 용액(20 mM 인산이수소나트륨·10 mM 헵탄설폰산나트륨, pH 2.0)을 분당 0.4 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 알리인(L(+)Alliin)

분자식 : C6H11NO3S, 분자량 : 177.22, CAS No. : 556-27-4

3.2 일반시약

3.2.1 헵탄설폰산나트륨(1-Heptanesulfonic acid, sodium salt, HPLC grade)

3.2.2 인산이수소나트륨(Sodium dihydrogenphosphate, anhydrous)

3.2.3 인산(Phosphoric acid)

3.2.4 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.5 증류수(Distilled water)

3.2.6 메탄올(Methanol)

3.2.7 포름산(Formic acid)

3.3 시액의 제조

3.3.1 20 mM 인산이수소나트륨·10 mM 헵탄설폰산나트륨용액

인산이수소나트륨 약 2.4 g과 헵탄설폰산나트륨용액 약 2.0 g을 물에 녹여 1L로 정용하고 인산으로 pH 2.0로 조절한다.

3.3.2 80% methanol 용액(pH 3.0)

Methanol:D.W를 80:20(v/v)의 비율로 혼합하고 포름산을 이용하여 pH 3.0로 조절한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질 알리인 10 mg을 정밀히 칭량하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2. 80% 메탄올(pH 3.0) 용액을 넣어 표선까지 맞추어 표준원액으로 한다.

4.1.3 표준원액을 80% 메탄올(pH 3.0)용액으로 적정농도로 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 100 mg을 정밀히 칭량하여 25 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.2 적당량의 80% 메탄올(pH 3.0)용액을 넣고 잘 흔들어 녹인다

4.2.3 10분간 초음파로 추출한다.

4.2.4 80% 메탄올(포름산으로 pH 3.0)로 25 mL가 되게 정용한다.

4.2.5 위의 용액을 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	30℃
이동상	A : 20 mM 인산이수소나트륨·10 mM 헵탄설폰산나트륨 용액(pH 2.0), B : 아세토니트릴 : 이동상 A(50:50)
검출기 파장	208 nm
유량	0.4 mL/min

표 2. 고속액체크로마토그래프 이동상 조성(예)

min	이동상(%)
	A	B
0	100	0
5	70	30
25	46	54
30	0	100
32	0	100
37	100	0
45	100	0

5.2 계산

5.2.1. 알리인 함량(mg/g) = C × (a × b)/S

C : 시험용액 중의 알리인의 농도(mg/mL)

S : 시료 채취량(g)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

부칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.  다만, 제 4. 건강기능식품 시험법 중 3-73 폴리감마글루탐산, 3-77 알리인은 2015년 1월 1일부터 시행하고, 3-74 히알루론산, 3-75 로사빈, 3-76 안토시아노사이드는 2016년 1월 1일부터 시행한다.

제2조(적용례) 이 고시는 고시 시행 이후 최초로 제조·가공 또는 수입한 건강기능식품(원료를 포함한다)부터 적용한다.

제3조(경과조치) ① 이 고시 시행 당시 검사가 접수되어 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정에 따른다.

② 이 고시 시행 당시 종전의 규정에 따라 제조․가공․수입(선적일을 기준으로 한다)한 건강기능식품은 종전의 규정에 따른다. 이 경우 해당 건강기능식품은 유통기한까지 판매할 수 있다.

신․구조문대비표

현  행

개 정 안

제 1 총칙

1. ∼ 5. (생 략)

6. 기능성 원료별 기준 및 규격의 추가 등재

「건강기능식품 기능성 원료 및 기준․규격 인정에 관한 규정」에 따라 인정된 기능성 원료는 다음의 어느 하나를 충족하면 「건강기능식품의 기준 및 규격」제 3. 개별 기준 및 규격에 추가로 등재할 수 있다. 다만 당해 영업자가 자료의 보호가 필요하다고 요청한 경우 그 타당성을 검토하여 기능성 원료로 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 날로부터 추가등재를 5년 이내에서 유예할 수 있다.

1) 건강기능식품의 기능성 원료로 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 날로부터 3년이 경과하였거나 3개 이상의 영업자가 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 경우

2)「건강기능식품에 관한 법률」제14조제2항의 규정에 의하여 인정받은 자가 등재를 요청하는 경우(다만 인정받은 자가 3명 이상인 경우에는 3분의 2가 건강기능식품공전에 등재를 요청하는 경우)

<신 설>

제 1 총칙

1. ∼ 5. (현행과 같음)

6. 기능성 원료별 기준 및 규격의 추가 등재

1)「건강기능식품 기능성 원료 및 기준․규격 인정에 관한 규정」에 따라 인정된 기능성 원료는 다음의 어느 하나를 충족하면 「건강기능식품의 기준 및 규격」제 3. 개별 기준 및 규격에 추가로 등재할 수 있다. 다만 당해 영업자가 자료의 보호가 필요하다고 요청한 경우 그 타당성을 검토하여 기능성 원료로 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 날로부터 추가등재를 5년 이내에서 유예할 수 있다.

(1) 건강기능식품의 기능성 원료로 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 날로부터 3년이 경과하였거나 3개 이상의 영업자가 인정받은 후 품목제조신고 또는 수입신고한 경우

(2)「건강기능식품에 관한 법률」제14조제2항의 규정에 의하여 인정받은 자가 등재를 요청하는 경우(다만 인정받은 자가 3명 이상인 경우에는 3분의 2가 건강기능식품공전에 등재를 요청하는 경우)

2)「건강기능식품 기능성 원료 및 기준·규격 인정에 관한 규정」제10조 제2항에 따른 기능성 내용 추가는 영업자가 인정받은 후 1년이 경과한 경우(다만, 인정받은 자가 건강기능식품공전에 등재를 요청하는 경우는 제외)

제 2. 공통기준 및 규격

1. (생 략)

1-1 건강기능식품 제조에 사용할 수 없는 원료는 다음 어느 하나와 같다.

1) ∼ 2) (생 략)

<신 설>

2. ∼ 6. (생 략)

제 2. 공통기준 및 규격

1. (현행과 같음)

1-1 건강기능식품 제조에 사용할 수 없는 원료는 다음 어느 하나와 같다.

1) ∼ 2) (현행과 같음)

3) ｢야생생물 보호 및 관리에 관한 법률｣ 제2조제2호 및 제3호에서 정한 품목에 해당하는 것

2. ∼ 6. (현행과 같음)

제 3. 개별기준 및 규격

1. 영양소

1) ∼ 6) (생 략)

1-1 ∼ 1-28 (생 략)

2. 기능성 원료

2-1 ∼ 2-13 (생 략)

2-14 밀크씨슬(카르두스 마리아누스) 추출물

2) 규격

(2) 실리마린(실리빈으로서)

2-15  (생 략)

2-16 오메가-3 지방산 함유 유지

2-17 ∼ 2-19 (생 략)

2-20 식물스테롤/식물스테롤에스테르

2) 규격

(2) 식물스테롤에스테르(식물스테롤에스테르를 원료로 사용한 경우)

2-21 ∼ 2-23 (생 략)

2-24 공액리놀레산

2) 규격

(3) cis-9 및 trans-11 공액리놀레산, trans-10 및 cis-12 공액리놀레산 함량(%) : 공액리놀레산 함량 중 90% 이상

제 3. 개별기준 및 규격

1. 영양소

1) ∼ 6) (현행과 같음)

1-1 ∼ 1-28 (현행과 같음)

2. 기능성 원료

2-1 ∼ 2-13 (현행과 같음)

2-14 밀크씨슬(카르두스 마리아누스) 추출물

2) 규격

(2) 실리마린

2-15  (현행과 같음)

2-16 EPA 및 DHA 함유 유지

2-17 ∼ 2-19 (현행과 같음)

2-20 식물스테롤/식물스테롤에스테르

2) 규격

(2) 식물스테롤(식물스테롤을 원료로 사용한 경우)

2-21 ∼ 2-23 (현행과 같음)

2-24 공액리놀레산

2) 규격

(3) cis-9 및 trans-11 공액리놀레산과 trans-10 및 cis-12 공액리놀레산의 함량(%) : 공액리놀레산 함량 중 90% 이상

[별표 4] 시험법 적용표

시험항목	적용규정	시험방법	비고
수분	식품의 기준 및 규격 (식품공전)	제10. 일반시험법 1.1.1 수분 ※ Ⅱ.2.7.1 로얄젤리는 1.1.1.3 칼피셔법에 따름
회분		제10. 일반시험법 1.1.2 회분
조지방		제10. 일반시험법 1.1.5.1 조지방
산가		제10. 일반시험법 1.1.5.3.1 산가
과산화물가		제10. 일반시험법 1.1.5.3.5 과산화물가
환원당		제10. 일반시험법 1.1.4.1.2 환원당
타르색소		제10. 일반시험법 2.4 착색료
납		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
카드뮴		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
총수은		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
총비소		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
세균수		제10. 일반시험법 3.5 세균수
대장균군		제10. 일반시험법 3.7 대장균군
대장균		제10. 일반시험법 3.8 대장균
살모넬라		제10. 일반시험법 3.11 살모넬라
세균발육		제10. 일반시험법 3.6 세균발육시험
테트라싸이클린클로르테트라싸이클린		제10. 일반시험법 5.3.49 옥시테트라싸이클린, 클로르테트라싸이클린, 테트라싸이클린, 독시싸이클린
총 아플라톡신		제10. 일반시험법 6.1.1 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)
포도당당량(D.E.)		제5. 식품별 기준 및 규격 6. 포도당 6) 시험방법 (1) 포도당당량(D.E.)
메탄올		제5. 식품별 기준 및 규격 27-1 탁주 6) 시험방법 (3) 메탄올
잔류용매	식품첨가물의 기준 및 규격 (식품첨가물공전)	제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 80. 파프리카추출색소
잔류용매 (이소프로필알콜)		제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 108. 글루코만난

[별표 4] 시험법 적용표

시험항목	적용규정	시험방법	비고
수분	식품의 기준 및 규격 (식품공전)	제10. 일반시험법 1.1.1 수분 ※ Ⅱ.2.7.1 로얄젤리는 1.1.1.3 칼피셔법에 따름
회분		제10. 일반시험법 1.1.2 회분
조지방		제10. 일반시험법 1.1.5.1 조지방
산가		제10. 일반시험법 1.1.5.3.1 산가
과산화물가		제10. 일반시험법 1.1.5.3.5 과산화물가
환원당		제10. 일반시험법 1.1.4.1.2 환원당
타르색소		제10. 일반시험법 2.4 착색료
납		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
카드뮴		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
총수은		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
총비소		제10. 일반시험법 7.1 중금속 시험
세균수		제10. 일반시험법 3.5 세균수
대장균군		제10. 일반시험법 3.7 대장균군
대장균		제10. 일반시험법 3.8 대장균
살모넬라		제10. 일반시험법 3.11 살모넬라
세균발육		제10. 일반시험법 3.6 세균발육시험
테트라싸이클린클로르테트라싸이클린		제10. 일반시험법 5.3.49 옥시테트라싸이클린, 클로르테트라싸이클린, 테트라싸이클린, 독시싸이클린
총 아플라톡신		제10. 일반시험법 6.1.1 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)
포도당당량(D.E.)		제5. 식품별 기준 및 규격 6. 포도당 6) 시험방법 (1) 포도당당량(D.E.)
<삭 제>		<삭 제>
잔류용매 (초산에틸)	건강기능식품의 기준 및 규격 (건강기능식품공전)	제4. 건강기능식품 시험법 2, 2-5, 2-5-5 초산에틸
잔류용매 (이소프로필알콜)	식품첨가물의 기준 및 규격 (식품첨가물공전)	제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 108. 글루코만난
잔류용매		제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 80. 파프리카추출색소

제 4. 건강기능식품 시험법

1. 일반원칙 (생  략)

2. 일반시험법 (생  략)

3. 개별 성분별 시험법

3-1 ∼ 3-3 (생  략)

3-4 비타민 E

3-4-1 비타민 E(제1법) (생  략)

3-4-2 비타민 E(제2법)

1. ∼ 4. (생  략)

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35℃
이동상	핵산 : 이소프로판올(98 : 2)
검출기 파장	여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm
유량	0.5 mL/분

<신 설>

5.2 계산 (생 략)

<신 설>

3-5 ∼ 3-25  (생 략)

3-26 식이섬유

3-26-1 식이섬유(제1법)

1. 시험방법의 요약
본 시험법은 시료 중 존재하는 지질과 수용성 물질들을 제거한 후 남은 잔사물의 중량을 측정하고 이때 조단백질량, 회분량을 측정하여 잔사물의 중량에서 빼주는 방법으로 식이섬유의 함량을 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 유리여과기(기공 40～60 μm, 용량 60 mL)

525℃에서 한 시간 가열한 다음 식혀 물로 세척하고 상온 건조하여 셀라이트 0.5 g을 가한 후 130℃에서 항량이 될 때까지 건조한 후 데시케이터에 옮겨 보관한다.

2.1.2 회화로

2.1.3 감압펌프(역류방지장치가 부착된 것)

2.1.4 교반기

2.1.5 감압건조기 또는 상압가열건조기

2.1.6 항온수조

2.1.7 데시케이터

2.1.8 pH 측정기

2.1.9 비커(200 mL)

<신 설>

<신 설>

<신 설>

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.1.1 ∼3.1.8  (생  략)

3.2 시액의 제조

3.2.1 85% 에탄올 용액

100% 에탄올 850 mL에 증류수를 가하여 1,000 mL로 한다.

3.2.2 78% 에탄올 용액

100% 에탄올 780 mL에 증류수를 가하여 1,000 mL로 한다.

3.2.3 세척용액

액상계면활성제(International Products사의 MICRO제품 또는 이와 동등한 것)를 증류수에 희석하여 2%용액으로 한다.

3.2.4 MES/TRIS 완충액

MES 19.52 g과 TRIS 12.2 g을 증류수 1.7 L에 녹이고 6 N 수산화나트륨용액으로 pH가 8.2가 되도록 조절한 후 증류수를 가하여 2 L로 한다. 용액의 온도가 20℃이면, pH 8.1로, 용액의 온도가 28℃이면 pH 8.3으로 조정한다.

3.2.5 0.561 N 염산용액

6 N 염산 93.5 mL에 증류수를 가하여 1,000 mL로 한다.

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

4. 시험과정

4.1 시험용액의 제조

4.1.1 시험은 두 개의 시료 및 공시험을 동시에 실시한다.

4.1.2 고운분말로 한 시료 약 1.0 g 2개(M1, M2)를 200 mL 비커에 취한다. 지방이 10%이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85%에탄올 용액으로 시료 1 g 당 10 mL씩으로 세척한다.

4.1.3 MES/TRIS용액 40 mL씩 가하고 마그네틱 교반하여 충분히 분산시킨다.

4.1.4 내열성 α-아밀라아제 용액 50 μL를 가하고 서서히 저어 혼합한다.

4.1.5 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 95～100℃의 수욕에서 40분간 교반한다.

4.1.6 반응이 끝난 후 60℃로 식히고 비커 벽이나 바닥에 내용물이 부착되어 있으면 시약스푼으로 긁어 분산시키고 증류수 10 mL로 스푼과 비이커 벽을 닦는다.

4.1.7 각각의 비커에 프로테아제용액 100 μL씩 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 약 60℃에서 30분간 교반하면서 항온 시킨다.

4.1.8 뚜껑을 제거하고 0.561 N 염산용액 5 mL를 가하여 흔들어 혼합 후 60℃에서 pH를 4.0～4.7로 조정한다.

4.1.9 아밀로글루코시다아제용액 300 μL을 넣고 흔들어 섞은 후 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 60℃에서 30분간 교반을 유지하며 항온시켜 시험용액으로 한다.

4.2 총 식이섬유 정량

4.2.1 상기[4.1] 시험용액 각각에 60℃의 95% 에탄올 225 mL을 가한다. 에탄올과 시험용액의 용량비율은 4 : 1로 한다.

4.2.2 실온에서 1시간 방치하여 침전시킨다.

4.2.3 미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 78% 에탄올 15 mL을 가하여 분산시킨 후 흡인여과 하여 셀라이트층이 고르게 형성되도록 한다.

4.2.4 위의 여과기에 시험용액을 넣어 여과하고 용기의 잔류물을 78% 에탄올로 씻어준다.

4.2.5 잔사는 78%에탄올, 95%에탄올, 아세톤 순으로 각각 15 mL씩 2회 씻는다.

4.2.6 아세톤이 잔류하지 않도록 충분히 흡인시킨 후 105℃의 건조기에서 하룻밤 건조시키고 데시케이터에서 1시간 방냉하여 항량으로 한 후 무게를 달아 여과기와 셀라이트의 무게를 뺀다.

4.2.7 하나의 여과기(M1) 잔사에 대하여 질소량을 측정하고 이에 6.25를 곱하여 단백질량으로 한다.

4.2.8 또 다른 하나의 여과기(M2) 잔사를 525℃에서 5시간 회화시킨 후 회분량을 구한다.

4.2.9 시료를 제외한 공시험을 하여 계산식에 따라 총 식이섬유의 함량을 구한다.

4.3 물불용성 식이섬유의 정량

4.3.1 미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 물 3 mL을 가하여 분산시킨 후 흡인여과 하여 셀라이트층을 고르게 한다.

4.3.2 4.1 의 시험용액을 여과하고 잔류물은 70℃의 물 10 mL로 2회 씻는다.

4.3.3 여액 및 세척액은 합하여 600 mL 비커에 모아 [4.5] 수용성식이섬유 정량용으로 한다.

4.3.4 잔류물은 곧바로 78%에탄올, 95%에탄올 그리고 아세톤 순으로 각 15 mL씩 2회 세척한다.

4.3.5 여과기의 잔사를 105℃의 건조기에서 하룻밤 건조시키고 데시케이터에서 1시간 방냉하여 항량으로 한 후 무게를 달아 여과기와 셀라이트의 무게를 뺀다.

4.3.6 하나의 여과기(M1) 잔사에 대하여 질소량을 측정하고 이에 6.25를 곱하여 단백질량으로 한다.

4.3.7 또 다른 하나의 여과기(M2) 잔사를 525℃에서 5시간 회화시킨 후 회분양을 구한다.

4.3.8 시료를 제외한 공시험을 하여 계산식에 따라 총 식이섬유의 함량을 구한다.

4.4 수용성 식이섬유의 정량

4.4.1 [4.3.3]에서 얻어진 여액 및 세척액에 60℃의 95% 에탄올을 4배정도 가하거나 여액을 물로 80 g으로 한다.

4.4.2 60℃의 95% 에탄올 320 mL을 가한다.

4.4.3 한 시간 방치하여 침전물을 형성시킨다.

5. 계산

5.1 계산

5.1.1 공시험값 B(mg) = 공시험평균잔사무게(mg) - PB - AB

PB : 공시험 단백질량(mg)

AB : 공시험 회분량(mg)

5.1.2 식이섬유함량(%) = 시료의 평균잔사 무게(mg)-P-A-B /시료의 평균 무게(mg) × 100

P : 단백질량(mg)

A : 회분량(mg)

B : 공시험값(mg)

3-26-2 식이섬유(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 주로 수용성 섬유소(삼당류 이상)을 함유한 시료에 적용하며, 액체크로마토그래프/시차굴절계를 이용하여 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 부피플라스크(100 mL, 50 mL)

2.1.5 알루미늄 호일

2.1.6 비커(200 mL)

2.1.7 항온 수조

2.1.8 유리관(안지름 20 mm, 길이 300 mm)

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

2.2 분석장비

2.2.1 ∼ 2.2.3 (생  략)

2.2.4 Sugar-Pak(안지름 6.5 mm, 길이 300 mm, 충진재 8% cross-linked resin/calcium ionic form) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상인 증류수를 분당 1 mL씩 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Glucose

분자식 : C6H12O6, 분자량 : 180.16, CAS No. : 50-99-7

3.1.2 Sucrose

분자식 : C12H22O11, 분자량 : 342.30, CAS No. : 57-50-1

3.2 일반시약

3.2.1 내열성 α-아밀라아제(α-amylase, heat stable, 냉장보존)

3.2.2 프로테아제(protease)

냉장 0～5℃ 보존하며, 사용시에 MES/TRIS 완충액으로 50 mg/mL가 되게 조제하여 사용한다.

3.2.3 아밀로글루코시다아제 용액(Amyloglucosidase)

냉장 0～5℃ 보존하며, 사용시에 조제하여 사용한다.

3.2.4 Amberlite IRA-96(OH형)

3.2.5 Amberlite 200(H형)

3.2.6 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid(MES)

3.2.7 Tris(hydroxymethyl)aminomethane(TRIS)

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

3.3 시액의 제조

3.3.1 MES/TRIS 완충액

MES 19.52 g과 TRIS 12.2 g을 증류수 1.7 L에 녹이고 6 N 수산화나트륨용액으로 pH가 8.2가 되도록 조절한 후 증류수를 가하여 2 L로 한다. 용액의 온도가 20℃이면, pH 8.1로, 용액의 온도가 28℃이면 pH 8.3으로 조정한다.

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

4. 시험과정

4.1 효소처리액의 조제

4.1.1 시료 약 1 g을 200 mL비커에 정밀히 칭량한다. 시료중의 지방질이 많은 경우 에테르 등을 이용하여 충분히 탈지한 후 사용한다.

4.1.2 증류수 50 mL을 가하여 용해한 후, 0.1 N 염산용액 혹은 수산화나트륨용액으로 pH 6.0으로 조정한다.

4.1.3 여기에 내열성 α-아밀라아제 용액 0.1 mL을 가하고, 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 끓는 수욕에서 30분간 놓아둔다.(5분 간격으로 교반)

4.1.4 실온 냉각 후 0.1 N 수산화나트륨 용액으로 pH 7.5±0.1로 조정한다.

4.1.5 프로테아제 0.1 mL을 가하고 알루미늄박으로 봉한 후 60℃ 수용액에서 30분간 진탕한다.

4.1.6 실온 냉각 후 0.1 N 염산용액으로 pH 4.5±0.2로 조정한다.

4.1.7 아밀로글루코시다아제 0.1 mL을 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 60℃ 수욕에서 30분간 진탕 후 수욕 중에서 10분간 가열하여 효소를 실활 시킨다.

4.1.8 실온 냉각 후 100 mL 부피플라스크에 옮겨 증류수를 표선까지 채운 액을 효소처리액(A)라고 한다.

4.2 효소처리액(A) 중의 포도당 정량

4.2.1 포도당, 설탕의 표준품을 각각 100 mL 부피플라스크에 정밀히 취한 후 증류수로 가하여 표선까지 채운다. 단, 시험용액 중 분석하고자 하는 농도가 검량선 내에 포함될 수 있도록 표준용액의 농도를 적절히 조절하여 사용한다.

4.2.2 효소처리액(A) 및 표준용액을 시험용액과 표준용액으로 하여 당의 함량을 구한다.

4.3 탈염처리액(B)

4.3.1 효소처리액(A) 50 mL을 취하여 「5. 분석 및 계산 5.1. 탈염 조건」에 맞는 이온교환수지 칼럼에 초당 1～2방울의 속도로 통과시켜 탈염한 칼럼용출액을 분취한다.

4.3.2 상기 칼럼에 증류수 약 150 mL을 초당 1～2방울 속도로 통과시킨 칼럼용출액을 분취한다.

4.3.3 칼럼용출액 200 mL을 감압농축하여 20 mL 부피플라스크에 옮기고 증류수를 표선까지 채운다.

4.3.4 이 액을 0.20 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

<신  설>

5. 분석 및 계산

5.1 탈염 조건

- 이온 교환 수지 Amberlite IRA-96(OH형), Amberlite-200(H형)을 1 : 1의 비율로 혼합한 것

- 칼럼 크기 : 유리관(안지름 20 mm, 길이 300 mm)

- 용리액 : 증류수

- 수지량 : 50 mL

이온교환수지 각각 OH형은 5% 수산화나트륨 용액으로, H형은 5% 염산용액으로 하루정도 충분히 활성화 시킨 후 물로 수차례 세척하여 수산화나트륨용액이나 염산용액이 잔존하지 않도록 하여 사용한다.

5.2 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	70℃
이동상	증류수
유량	0.4 mL/분

5.3 계산

5.3.1 포도당 중량(mg) = A x (B/C) / 1,000

A : 시험용액 중 당질의 농도(μg/mL)

B : 시험용액 전량(mL)

C : 희석배수

5.3.2 난소화부 중량(mg) = A / B x C

A : 난소화부의 피크 면적

B : 포도당의 피크면적

C : 포도당의 중량(mg)

3-27 ∼ 3-72 (생 략)

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

<신 설>

제 4. 건강기능식품 시험법

1. 일반원칙 (현행과 같음)

2. 일반시험법 (현행과 같음)

3. 개별 성분별 시험법

3-1 ∼ 3-3 (현행과 같음)

3-4 비타민 E

3-4-1 비타민 E(제1법) (현행과 같음)

3-4-2 비타민 E(제2법)

1. ∼ 4. (현행과 같음)

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35℃
이동상	헥산 : 이소프로판올(98 : 2)
검출기 파장	여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm
유량	0.5 mL/분

※ 정량시험을 위해 시험용액 1.0 mL에 토콜표준용액 1.0 mL를 가해(S) 이 용액의 10 μL를 분석한다. 또한 토코페롤동족체 각각에 대하여 각각 토코페롤 표준용액 1.0 mL를 취해 이에 토콜표준용액 1.0 mL를 가해 이 용액의 10 μL를 분석한다.

S : 시험용액에 함유된 토콜의 함량(mg)

5.2 계산 (현행과 같음)

3-4-3 비타민 E(제3법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 일반 식품인 경우 시료 중 비타민 E를 수산화칼륨용액과 피로갈롤·에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 헥산/초산에틸(9:1)혼합용액으로 추출 후 감압 건조시켜 헥산을 가하여 녹여 형광검출기를 이용하는 방법과 유지식품의 경우 비누화조작을 생략하고 헥산으로 추출한 후 형광검출기를 이용하여 여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm에서 검출하고 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 갈색플라스크(100 mL)

2.1.5 갈색부피플라스크(25, 100 mL)

2.1.6 원심분리기

2.1.7 갈색원심분리관(50 mL)

2.1.8 감압농축기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD)

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 순상형 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 NH2) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 헥산과 초산에틸을 80 : 20으로 혼합하여 분당 1.0 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 α-Tocopherol((±)-α-Tocopherol; DL-all-rac-α-Tocopherol; Vitamin E)

분자식 : C29H50O2, 분자량 : 430.71, CAS No. : 10191-41-0

3.2 일반시약

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 피로갈롤(Pyrogallol)

3.2.3 증류수(Distilled water)

3.2.4 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.5 초산에틸(Ethyl acetate)

3.2.6 헥산(n-Hexane)

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 60% 수산화칼륨 용액

수산화칼륨 60 g을 증류수에 녹여 100 mL로 조제한다.

4.1.2 1% 염화나트륨 용액

염화나트륨 1 g을 증류수에 녹여 100 mL로 조제한다.

4.2 표준용액 제조

4.2.1 토코페롤동족체 표준용액

4.2.1.1 표준원액 : 토코페롤 동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)을 각각 50 mg씩 정밀히 취해 50 mL 갈색부피플라스크에 넣고 헥산으로 표선까지 채워 조제한다.

4.2.1.2 표준용액 : 각각 토코페롤 동족체 표준원액  5 mL씩 취하여 50 mL 갈색부피플라스크에 넣고 헥산으로 표선까지 채워 조제한 후 갈색유리병에 넣어 질소로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보관한다.

4.2.1.3 검량곡선표준용액 : 각각 표준원액을 적당량 취하여 갈색플라스크에 넣고 헥산으로 희석하여 1∼10 ug/mL이 되도록 조제한다. 보관 시에는 질소로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보관한다.

4.3 시험용액 제조(일반식품)

4.3.1 토코페롤로서 약 0.2 mg에 해당하는 시료를 정밀히 취하여 갈색 원심분리관에 넣는다.

4.3.2 1% 염화나트륨 용액 0.5 mL을 넣고 3% 피로갈롤 에탄올 용액 10 mL과 60% 수산화칼륨 용액 1 mL을 가하여 70℃ 수욕 중에 30분간 진탕하며 비누화한다.

4.3.3 이를 흐르는 물에 냉각하고 1% 염화나트륨 용액 22.5 mL을 가한 후 헥산․초산에틸(9 : 1) 혼합용액을 15 mL가하여 10분간 진탕한다.

4.3.4 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층을 갈색플라스크로 옮긴다.

4.3.5 하층에 헥산․초산에틸(9 : 1) 15 mL을 가하여 2회 반복 추출하여 상층액을 합한다.

4.3.6 회수한 상층액을 감압농축한다.

4.3.7 위의 잔류물에 일정량의 헥산을 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

4.4 시험용액 제조(유지식품)

시료가 유지인 경우에는 비누화 조작을 생략하고, 고속액체크로마토그래프에 직접 주입할 수 있다.

4.4.1 유지 약 1 g을 정밀히 취해 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.4.2 헥산을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.4.3 위 용액의 일정량을 취해 헥산으로 희석한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35℃
이동상	헥산 : 초산에틸(80 : 20)
검출기 파장	여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm
유량	1.0 mL/분

5.2 계산

α, β, γ, δ-토코페롤의 함량(mg/100 g)	=	C	×	(a × b)	×	100
				S		1,000

C：시험용액 중의 α, β, γ, δ-토코페롤의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수

S : 시료 채취량(g)

3-5 ∼ 3-25 (현행과 같음)

3-26 식이섬유

3-26-1 식이섬유(제1법)

1. 시험방법의 요약

건조된 시료 두 개를 준비하고 이를 내열성 α-아밀라아제, 프로테아제, 아밀로글루코시다제 효소로 연속적으로 분해하여 전분과 단백질을 제거한다. 이때 10% 이상의 지방을 함유한 식품은 건조 전에 지방을 제거하여 시험한다. 총 식이섬유(TDF) 정량은 효소분해물에 녹아 있는 식이섬유를 에탄올로 처리하여 침전시켜 여과하고 에탄올과 아세톤으로 세척한 후, 건조하여 그 무게를 확인한다. 물불용성 식이섬유(IDF)는 효소분해물을 여과하여 잔사를 따뜻한 물로 세척하고 그 무게를 확인하여 정량한다. 수용성식이섬유(SDF)는 IDF의 전처리과정에서 얻은 여과액과 세척액을 합하여 에탄올로 침전시킨 후 여과하여 잔류물을 건조하고 무게를 확인하여 정량한다. 총 식이섬유, 물불용성 및 수용성식이섬유 함량계산 시 잔사의 무게 중 단백질 및 회분량은 보정해준다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 비이커 : 400 또는 600 mL Tall-form.

2.1.2 유리여과기 : 기공 40～60 μm(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 대기 중 방치하여 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

2.1.3 진공장치 : 조절장치를 갖춘 진공펌프나 아스피레이터, 1L 용량의 여과용 가지달린 플라스크 및 여과용 플라스크에 사용하는 고무 아답터

2.1.4 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온 및 온도의 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것

2.1.5 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것

2.1.6 회화로 : 525±5℃ 유지할 수 있는 것.

2.1.7 오븐 : 105℃와 130±3℃ 유지할 수 있는 것

2.1.8 데시케이터 : 실리카겔이나 이와 동등한 건조제가 있는 것. 건조제는 필요 시 130℃에서 하룻밤 동안 건조하여 사용한다.

2.1.9 pH meter : 온도 보정이 되고 pH 4, 7, 10 버퍼용액으로 표준화 된 것

2.1.10 피펫 : 일회용 팁이 사용가능한 것으로 용량 100～300 uL 및 5 mL

2.1.11 디스펜서 : 15±0.5 mL용 3개(78% ethanol, 95% ethanol, acetone용), 40±0.5 mL용 1개(버퍼용)

2.1.12 자석 교반기 및 마크네틱바

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

3.1.1 ∼3.1.8  (현행과 같음)

3.2 시액의 제조

3.2.1 에탄올 수용액

(1) 85% : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 895 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

(2) 78% : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

3.2.2 내열성 α-아밀라아제 용액 : 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3306 또는 이와 동등한 것)

※ (1) 가용성 전분을 기질로 하는 Nelson/Somogyi reducing sugar 방법에 기초하는 것 : 10,000±1,000 units/mL(1 unit: pH 6.5, 40℃에서 1분당 1 μmole reducing sugar equivalents를 만드는 데 필요한 효소의 양)

※ (2) 내열성 α-글루코시다제의 존재 시 기질로 p-nitrophenyl -maltosaccharide를 사용하는 Ceralpha방법에 기초한 것 : 3,000±300 Ceralpha units/mL(1 unit: pH 6.5, 40℃에서 1분당 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양)

3.2.3 프로테아제 효소용액: 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 MES/TRIS 완충액으로 희석하여 50 mg/mL로 사용 시 조제한다(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것)

※ (1) Casein assay: 300～400 units/mL (1 unit: pH 8.0, 40℃에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양) ; 7～15 units/mg (1 unit: pH 7.5, 37℃에서 casein으로부터 1분당 1.0 μmole tyrosine에 해당하는 색 (Folin-Ciocalteau reagent)을 내는데 필요한 효소의 양)

(2) Azo-casein assay : 300～400 units/mL(1 unit endo- peptidase activity: pH 8.0, 40℃에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양)

3.2.4 아밀로글루코시다제 용액 :  아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)     ※ (1) Starch/glucose oxidase-peroxidase 방법 : 2,000～3,300 units/mL(1 unit: pH 4.5, 40℃에서 1분당 1 μmole 포도당을  만드는 데 필요한 효소의 양)

(2) PNPBM (p-nitophenyl β-maltosidase) 방법 : 130～200 units/mL(1 unit: β-글루코시다제가 과량 존재할 때, 40℃에서 1분당 p-nitrophenyl β-maltosidase가 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양)

3.2.5 규조토(Diatomaceous earth) : 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, 산세척 또는 그와 동등한 것)

3.2.6 세척용액 : 실험실용 액체  계면활성 세정제(International products사의  Micro 혹은 그와 동등한 것)를 2% 수용액으로 조제한다.

3.2.7 MES : 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid(Sigma사 Catalog No. M-8250 또는 이와 동등한 것)

3.2.8 TRIS : Tris(hydroxymethyl) aminomethane(Sigma사 Catalog No. T-1503 또는 이와 동등한 것)

3.2.9 MES-TRIS 완충용액(0.05 M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2) : MES 19.52 g과 TRIS 12.2 g을 물 1.7 L에 녹인 후 6 N 수산화나트륨용액을 가하여 pH 8.2로 조절한 후, 물을 가하여 2 L가 되게 조제한다(24℃에서 pH 8.2로 조절하는 것이 중요하다. 만약 버퍼용액의 온도가 20℃이면 pH 8.3으로 조절하고, 28℃이면 pH 8.1로 조절한다).

3.2.10 염산용액(0.561 N) : 1 L 정용 플라스크에 물 약 700 mL를 넣고 6 N HCl 93.5 mL을 혼합한 후 증류수로 표선까지 채워 조제한다.

4. 시험과정

4.1 시험용액의 제조

4.1.1 시료 균질화

건조된 시료의 총 식이섬유를 확인하기 위해서 시료를 균질화한 후, 70℃ 진공오븐에서 하룻밤 동안 건조시킨다. 시료를 데시케이터에서 방냉하고 0.3～0.5 mm mesh가 되도록 건식 분쇄한다. 열처리를 할 수 없는 시료의 경우 분쇄하기 전에 냉동 건조한다. 지방함량이 높다면(10% 이상) 분쇄하기 전에 석유에테르로 탈지한다(시료 1 g당 25 mL 씩 3번 처리). 지방제거로 인한 무게 손실을 기록하고 이에 대한 총 식이섬유 함량(%)을 보정한다. 분석 전까지 건조-분쇄된 시료는 마개가 있는 병에 담아 데시케이터에서 보관한다(만약 시료의 지방함량을 모른다면, 식이섬유를 측정하기 전에 탈지한다). 당 함량이 높은 제품은 식이섬유 측정 전에 85% 에탄올(10 mL/g)로 2～3회 추출한 다음 상등액을 제거하고 40℃에서 하룻밤 동안 건조한다.

4.1.2 효소분해

4개의 400 mL(또는 600 mL) tall-form 비이커에 시료 1.000± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  MES-TRIS 완충용액 40 mL씩 가하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산될 때까지 자석 교반하여 혼합한다. 저속으로 혼합하면서, 내열성 α-아밀라아제 용액 50 μL을 첨가한다. 비이커를 알루미늄박으로 덮은 후 95∼100℃ 수욕에서 15분 동안 계속 교반하면서 반응한다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비이커를 꺼내어 60℃로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비이커의 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비이커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 프로테아제 효소용액 100 μL을 각 비이커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비이커를 덮고 60±1℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 알루미늄박을 제거한 후 비이커를 잘 교반하면서 0.561 N HCl 5 mL을 넣어준다. 60℃에서 1 N NaOH, 1 N HCl를 사용하여 용액을 pH 4.0～4.7로 조정한다(※ 참고 : pH는 낮은 온도에서 올라가기 때문에 60℃에서 pH를 조정하고 확인하는 것이 중요하다. 대부분의 곡류, 채소 시료의 경우, pH 조정이 없이도 pH조건을 만족할 수 있으므로 이전에 확인된 시료의 경우, pH 조정 과정을 생략할 수 있다. 단, 공시험의 pH를 예비단계로 확인하고 만약 공시험의 pH가 올바른 범위를 벗어난다면, 반드시 시료의 pH를 점검한다). 비이커를 교반하면서 아미노글루코시다제 용액 300 μL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60±1℃ 수욕에서 교반하면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

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4.2 총 식이섬유(TDF) 함량 측정

4.2.1 실온 기준 225 mL 95% 에탄올을 60℃에서 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비이커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 1시간 침전시킨다. ☆미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에  78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인 여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비이커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 78% 에탄올, 95% 에탄올, 아세톤 순으로 각각 15 mL씩 2회 잔류물을 씻는다. ★105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 동안 건조시키고, 데시케이터에서 1시간 동안 방냉하여 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

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4.3 물불용성 식이섬유(IDF) 측정

4.3.1 미리 규조토를 넣어 항량하여 준비한 유리여과기에 물 3 mL을 가하여 규조토를 적시고 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층을 고르게 한다. 이에 시험용액 조제에서 얻어진 효소분해물을 유리여과기를 통해 여과용 플라스크로 여과한다. 비이커를 세척하면서 잔류물을  70℃ 물 10 mL로 2회 세척한다. 여액과 물 세척액을 합치고, 미리 무게를 칭량한 600 mL 비이커로 옮겨 9) 수용성 식이섬유 측정에 사용한다. 잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15 mL씩 2회 세척한다(주의: 잔류물의 세척을 즉시 하지 않을 경우, IDF 값이 높아질 수 있다). 7) 총식이섬유 함량 측정 과정의 ★ 이하에 따라 IDF의 무게를 계산한다.

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4.4 수용성 식이섬유(SDF) 측정

4.4.1 물불용성 식이섬유 측정에서 600 mL 비이커로 옮긴 여액과 물 세척액의 무게를 확인하여 부피를 확인하고 미리 60℃로 가열된 95% 에탄올을 측정한 부피의 4배량을 가한다. 이때 60℃ 에탄올의 일부를 이용하여 여과용 플라스크에 남은 여액과 물 세척액을 세척한다. 여과액과 물 세척액에 에탄올을 4배량 가하기 위한 방법으로 물을 첨가하여 여과액과 물 세척액의 무게를 80 g으로 맞추고, 60℃의 95% 에탄올 320 mL을 가할 수도 있다. 그 후, 상온에서 1시간 침전시킨 후, 7) 총 식이섬유 함량 측정 중 ☆이하에 따라 SDF의 함량을 측정한다.

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5. 계산

5.1 계산

※ 총 식이섬유 함량은 7) 총 식이섬유(TDF) 함량 측정을 독립적으로 수행하여 결정하거나 8) 물불용성 식이섬유(IDF) 측정 및 9) 수용성 식이섬유(SDF) 측정에서 구한 IDF와 SDF의 합으로 결정할 수 있다.

가) 공시험 함량 (B, mg) 측정:

B = [(B1R + B2R) / 2] - PB - AB

B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사의 무게(mg)

PB: 공시험(B1)의 단백질 무게(mg)

AB: 공시험(B2)의 회분 무게(mg)

나) 식이섬유 함량(DF, g/100g) 측정:

[eqn: DF= {{[M1R+M2R]} over {2} -P-A-B} over {{(M1`+M2)} over {2}} TIMES 100]

M1R, M2R : 검체 2반복의 잔사 무게(mg)

P : 잔사(M1R) 중 단백질 무게(mg)

A : 잔사(M2R) 중 회분 무게(mg)

B : 공시험 함량(mg)

M1, M2: 검체의 무게(mg)

3-26-2 식이섬유(제2법)

1. 시험방법의 요약

난소화성 말토덱스트린(RMD) 등을 함유한 식품에 인산완충액을 이용한 효소-중량법을 적용하여 에탄올에 의해 침전되는 고분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(HMWSDF)를 확인하고 에탄올에 녹는 저분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(LMWSDF)를 탈염하여 농축한 후, 액체크로마토그래피로 확인하는 방법이다. 이 방법에서 총 식이섬유는 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF와 액체크로마토그래피로 확인한 LMWSDF의 합으로 계산되어진다. 즉 효소-중량법으로 구한 식이섬유의 함량에 알코올에 녹는 수용성 식이섬유의 함량을 합하여 총 식이섬유의 함량으로 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것

2.1.2 비이커 : 500 mL Tall-form

2.1.3 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온하여 온도 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것

2.1.4 유리여과기 : 기공 40～60 μm(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

2.1.5 유리 또는 플라스틱 칼럼관: 이온교환수지를 채우기 위한 것으로 40∼70 cm × 15 mm 내경의 칼럼관

2.1.6 유리막대 : 20 cm 길이로 끝을 열처리한 것.

2.1.7 일회용 주사기 : 10 mL

2.1.8 파스퇴르 피펫, 10 mL 정용피펫

2.1.9 저울 : 4,000 g 용량

2.1.10 테프론 막대 : 비이커의 침전물을 모을 수 있는 것

2.1.11 용량플라스크 : 10, 50, 250 및 1,000 mL

2.1.12 감압농축기

2.2 분석장비

2.2.1 ∼ 2.2.3 (현행과 같음)

<삭  제>

<삭  제>

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 액체크로마토그래피 머무름 시간 확인용 표준물질: 저분자의 난소화성 말토덱스트린에 해당하는 올리고당[DP(Degree of polymerization)≥3]을 포함한 DE(Dextrose equivalent) 25 또는 16.5～19.5의 말토덱스트린(Sigma사 419699 또는 이와 동등한 것)

3.1.2 Glycerol

분자식 : C3H8O3, 분자량 : 92.09, CAS No. : 56-81-5

3.2 일반시약

3.2.1 증류수 : 3차 증류수

3.2.2 에탄올 : 95% Technical grade

3.2.3 에탄올 수용액(78%)

1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

3.2.4 인산수소나트륨(Na2HPO4) 및 인산이수소나트륨(NaH2PO4)

3.2.5 내열성 α-아밀라아제 용액: Termamyl 120 또는 이와 동등한 것, 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3403 또는 이와 동등한 것).

3.2.6 프로테아제 효소용액: 1.1.4.3. 가. 4)시약 및 시액 라)의 효소분해능을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 인산 완충용액으로 희석하여 10 mg/mL로 사용 시 조제한다(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것).

3.2.7 아밀로글루코시다제 용액 : 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

3.2.8 규조토(Diatomaceous earth): 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, acid washed 또는 이와 동등한 것)

3.2.9 각 시료의 탈염을 위한 이온교환수지

(1) m-1 : 25 g Amberlite IRA-67 (OH-type) 또는 이와 동등한 것

(2) m-2 : 25 g Amberlite 200 CT(HG)H(H-type) 또는 이와 동등한 것

3.2.10 황산암모늄

3.2.11 덱스트로즈 : 액체크로마토그래피용, 순도 99.5% 이상

3.3 시액의 제조

3.3.1 인산 완충용액(0.08M, pH 6.0)

무수 인산수소나트륨 1.4 g(또는 2수화물 1.753 g)과 9.68 g 인산이수소나트륨·1수화물(또는 2수화물 10.94 g)을 700 mL 증류수에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다. 이때 pH를 확인한다.

3.3.2 각 시료의 탈염을 위한 이온교환수지

(1) m-1 : 25 g Amberlite IRA-67(OH-type) 또는 이와 동등한 것

(2) m-2 : 25 g Amberlite 200 CT(HG)H(H-type) 또는 이와 동등한 것

각 시험 용액의 분석을 위해서 유리칼럼에 상기 2종의 수지를 잘 혼합하여 충진 한다.

․총 이온교환능 : 1.74 meq/mL

․유효 이온교환능(R-H 교환능) : 1.6 meq/mL(min.)

․상기 2종의 수지를 혼합하여 충진하기 전 각 수지를 증류수로 세척하고 세척액의 pH가 m-1은 7～8.8, m-2는 4～7의 값이 되도록 한다.

※ Amberlite 200 CT(HG)H가 없을 경우, Amberlite 200 (Na-type) 또는 Amberlite 200CT를 'H-type'으로 전환하여 사용한다. 이를 위해 Amberlite 200(Na-type) 600 mL (500 g)을 유리 또는 플라스틱 칼럼관(100 cm × 40 mm id)에 채우고 2배 부피의 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하고 2배 부피의 10% 염산용액(1→3 w/w)을 재차 60 mL/min의 속도로 흘려준 후 수지의 3배 부피에 해당하는 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하여 염산을 제거한다. 3～6배의 부피에 해당하는 증류수를 120 mL/min의 속도로 재차 세척하고 세척액의 pH가 4～7인지 확인하여 염산용액의 세척이 제대로 이루어졌는지 확인하여 사용한다.

3.3.3 수산화나트륨 수용액(0.274 N)

NaOH 11 g을 증류수 약 700 mL에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

3.3.4 염산용액(0.325 N)

1 L 정용 플라스크에 1 N HCl 325 mL을 넣고 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

3.3.5 글리세롤 표준용액(10 mg/mL)

비이커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 1L 정용플라스크로 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

3.3.6 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액(100 mg/mL)

비이커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 100 mL 정용플라스크에 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

4. 시험과정

4.1 시료 균질화

4.1.1 제 10, 1, 1.1, 1.1.4, 1.1.4.3. 식이섬유 가. 효소-중량법 6) 시험용액 조제 가)와 같이 준비한다. 당 함량이 높은 시료의 경우, LMWSDF의 손실을 고려하여 85% 에탄올 세척과정은 생략한다.

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

4.2 효소분해

4.2.1 4개의 500 mL tall-form 비이커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  인산 완충용액 50 mL씩 가하고 초음파를 이용하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산시킨다. 내열성 α-아밀라아제 용액 100 μL을 첨가한다. 비이커를 알루미늄박으로 덮은 후 95℃ 수욕에서 30분 동안 계속 진탕하면서 반응시킨다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비이커를 꺼내어 실온으로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비이커에 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비이커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 0.275 N 수산화나트륨용액으로 pH를 7.5±0.1로 조정한 후, 프로테아제 효소용액 0.5 mL를 각 비이커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비이커를 덮고 60℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 실온으로 용액을 식힌 후, 알루미늄박을 제거한 후 비이커를 잘 교반해주면서 0.325 N HCl로 용액의 pH를 4.5±0.2로 조정한다. 비이커를 교반해주면서 아미노글루코시다제 용액 0.3 mL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60℃ 수욕에서 지속적으로 흔들면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

<삭  제>

4.3 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF의 함량 측정

4.3.1 60℃로 가열한 95% 에탄올을  60℃ 수욕 상의 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피의 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비이커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 하룻밤 침전시킨다. 미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에 있는 78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인 여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약 스푼을 이용하여 비이커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 20 mL 78% 에탄올 3회, 10 mL 95% 에탄올로 2회, 10 mL 아세톤으로 2회씩 잔류물을 씻어낸다. 105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 건조시키고, 유리여과기를 데시케이터에서 1시간 동안 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

4.4 여액 회수 및 탈염

4.4.1 4.3의 여액을 감압농축기로 농축하여 완전 건고하고 잔류물을 소량의 물로 녹인 후, 이를 50 mL 정용플라스크에 정량적으로 옮긴다. 이에 글리세롤 표준용액 10 mL을 넣고 증류수로 표선까지 채워 50 mL로 조제한다. 이를 Amberlite IRA-67(m-1) 및 Amberlite  200CT(HG)H(m-2) 각 25 g을 완전히 혼합하여 채운 유리칼럼(75 cm × 15 mm id)에 통과시키고 이후, 250 mL 증류수로 칼럼을 통해 세척하며 추출한다. 이때 유속은 0.8 mL/min으로 조정한다.   이온교환 칼럼을 통과한 초기 용출액부터 250 mL를 모아 정량적으로  500 mL 둥근 플라스크에 옮기고 완전 건고될 때 까지 감압농축한다. 이를 10 mL 정용플라스크로 증류수를 이용하여 정량적으로 옮겨 10 mL로 조제한 후 10 mL 일회용 주사기에 옮겨 0.2 μm 맴브레인 필터로 여과하여 액체크로마토그래피용 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 시험조작

5.1.1 액체크로마토그래프의 측정조건

- 분석칼럼 : TSK-GEL G2500PWX L, 7.8 mm id × 30 cm를 연속하여 2개를 연결한 것 또는 이와 동등한 것

- 가드 칼럼 : TSK guard column PWXL, 6.0 mm id × 4 cm 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도 : 80℃

- 이동상 : 증류수

- 유속 : 0.5 mL/min

- 주입량 : 20 μL

- 검출기 : 시차굴절계검출기(RI), 40℃ 유지

5.1.2 RMD와 액체크로마토그래피 반응이 동등한 덱스트로즈로 반응계수 결정

RMD의 RI 검출기의 반응에 대한 평가와 표준화를 위해 글리세롤 표준물질을 사용한다. LC 분석에서 RI 검출기에서 얻은 RMD의  피크면적은 덱스트로즈와 동등하며 내부표준물질인 글리세롤의 피크면적과 덱스트로즈의 농도에 따른 피크면적을 비교한다. 이렇게 작성된 검량곡선으로부터 시험용액 중 RMD의 함량을 계산하는데 사용할 반응계수를 결정한다.

동량의 글리세롤과 3개 농도 수준으로 덱스트로즈를 100 mL 정용플라스크에 각각 넣은 3개의 용액을 준비한다. 이를 위해 0.5, 1.0, 2.0 g의 덱스트로즈를 3개의 구분된 100 mL 정용플라스크에 정확히 칭량하여 넣고 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액 10 mL을 각 정용 플라스크에 첨가한 후 증류수를 채워 100 mL로 조제한다. 조제된 3개의 표준용액 20 μL를 액체크로마토그래피에 주입하여 각 크로마토그래피에서 덱스트로즈와 글리세롤의 피크면적을 확인하여 글리세롤의 피크면적에 대한 덱스트로즈 피크면적 비(y-축)와 글리세롤 함량에 대한 덱스트로즈 함량 비(x-축)을 비교하여 얻어진 기울기의 역수로부터 아래의 식과 같이 반응계수를 구한다.

반응계수(Rf) = 1/[(PA-dex/PA-gly) × (Wt-gly/Wt-dex)]

PA-dex : 덱스트로즈 피크면적

PA-gly : 글리세롤 피크면적

Wt-dex : 표준용액 중 덱스트로즈 함량

Wt-gly : 표준용액 중 글리세롤 함량

5.1.3 액체크로마토그래피의 크로마토그램

그림 1. 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램

5.2 식이섬유 함량 계산

※ 총 식이섬유 함량(TDF)은 %(IDF+HMWSDF)와 LMWSDF의 평균 함량(%ALMWSDF)을 합하여 계산한다.

5.2.1 (IDF + HMWSDF)의 함량 계산

(1) 공시험 함량(B, mg) 측정:

B = [(B1R +B2R) / 2] - PB - AB

B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사의 무게(mg)

PB: 공시험(B1)의 단백질 무게(mg)

AB: 공시험(B2)의 회분 무게(mg)

5.2.2 (IDF + HMWSDF) 평균 함량(g/100g) 측정:

[eqn: %(IDF+HMWSDF)= {{[M1R+M2R]} over {2} -P-A-B} over {{(M1`+M2)} over {2}} ` TIMES `100]

M1R, M2R: 검체 2반복의 잔사 무게(mg)

P: 잔사(M1R) 중 단백질 무게(mg)

A: 잔사(M2R) 중 회분 무게(mg)

B: 공시험 함량(mg)

M1, M2: 검체의 무게(mg)

5.2.3 LMWSDF의 평균 함량

5.2.3.1 LMWSDF(mg) 측정:

LMWSDF	=	PAS_LMWSDF × WtS_gly × Rf
		PAS_gly

PAS_LMWSDF : 시험용액 중 LMWSDF(DP≥3)의 피크면적

PAS_gly : 시험용액 중 글리세롤의 피크면적

WtS_gly : 시험용액에 첨가한 글리세롤의 무게(mg)

Rf : 덱스트로즈-글리세롤 반응계수

5.2.3.2 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100g) 측정

%LMWSDF	=	LMWSDF × 100
		SW

SW : 시료의 무게(mg)

5.2.3.3 LMWSDF의 평균 함량(g/100g)

%ALMWSDF	=	%LMWSDF + %LMWSDF'
		2

%LMWSDF, %LMWSDF' : 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100 g)

<삭  제>

3-27 ∼ 3-72 (현행과 같음)

3-73 폴리감마글루탐산

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 폴리감마글루탐산을 산분해한 후 아미노산 자동분석기를 이용하여 분석하는 방법으로 570 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 아미노산 자동분석기

2.2.2 이온 교환 칼럼으로 HR NA 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 200 mm, 유리아미노산 분석용) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

완충액, 발색시약의 유무, 칼럼항온조의 온도를 점검하고, 자동완충액 전환기구 및 정유량 펌프, 유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실시한다.

2.3.1 아미노산 자동분석기 관련 시약

2.3.1.1 닌히드린시약(Ninhydrin reagent, 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

2.3.1.2 구연산리튬완충액(Lithium citrate buffer, 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

2.3.1.3 완충액(기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 폴리감마글루탐산(Poly-[gamma] -glutamic acid)

분자식 : C15H21N3O9X2, 분자량 : 387.34, CAS No. : 84960-48-5

3.2 일반시약

3.2.1 염산(Hydrochloric acid)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 메탄올(Methanol)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질 폴리감마글루탐산 10 mg을 정밀히 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 증류수를 넣어 표선까지 맞추어 표준원액으로 한다.

4.1.3 표준원액을 0.02N 염산용액으로 적정농도로 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 100 mg을 정밀히 칭량하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.2 적당량의 증류수를 넣고 잘 흔들어 녹인다.

4.2.3 10분간 초음파로 추출한다.

4.2.4 증류수로 10 mL가 되게 정용한다(A).

4.2.5 (A)액 0.5 mL를 취하여 6N 염산 10 mL를 가한 후 110℃에서 24시간 가수분해한다.

4.2.6 위의 용액을 50 mL 부피플라스크에 옮겨 증류수로 정용한 다음 0.02 N 염산용액으로 10배 희석하여 시험용액으로 한다.

4.2.7 시험용액을 아미노산 자동분석기로 분석하여 총 글루탐산 함량(%)을 구한다.

4.2.8 산으로 가수분해 하지 않은 (A)액은 0.02 N 염산용액으로 10배 희석하여 아미노산 자동분석기로 분석하여 유리 글루탐산 함량(%)을 구한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 아미노산 자동분석기조건(예)

항목	조건
주입량	20 uL
칼럼온도	38∼78℃
흡광검출기 파장	570 nm
완충액	0.35 mL/min
반응액	닌히드린 시약 : 0.30 mL/min
반응기온도	135℃

5.2 계산

5.2.1 폴리감마글루탐산 함량(mg/g) = (총 글루탐산 함량 × 0.88) - 유리 글루탐산 함량

* 총 글루탐산 함량(mg/g)= (H × V × D)/(S × 1,000)

H : 가수분해한 시험용액의 총 글루탐산 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

D : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

* 유리 글루탐산 함량(mg/g) = (C × V × D)/(S × 1,000)

C : (A)액의 유리 글루탐산 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

D : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

* 0.88 = 129 (폴리글루탐산중의 글루탐산 잔기의 분자량)/147  (글루탐산 분자량)

3-74 히알루론산

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료로부터 추출한 히알루론산을 콘드로이티나아제 ABC를 이용하여 특이적으로 분해시켜 얻은 이당류를 액체크로마토그래프를 사용하여 분석하는 방법이다. 음이온을 가진 이들 분해산물을 음이온교환수지 칼럼을 이용하여 232 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

2.1.6 교반기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 강염기성의 암모늄이온 교환수지로 코팅된 실리카겔), Hypersil GOLD SAX 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 0.05M NaCl(pH 3.5)을 분당 1.0 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Hyaluronic acid sodium salt(Poly(β-glucuronic acid-[1→3]-β-N-acetylglucosamine -[1→4]), alternating)

분자식 : (C14H21NaNO11)n, 분자량 : 401.3, CAS No. :  9067-32-7

3.2 일반시약

3.2.1 콘드로이티나아제 ABC (Chondroitinase ABC)

3.2.2 트리스염(Tris base)

3.2.3 아세트산나트륨(Sodium acetate)

3.2.4 염산(Hydrochloric acid)

3.2.5 증류수(Distilled water)

3.3 시액의 제조

3.3.1 33 mM Tris-HCl 완충용액 제조

트리스염 3.99 g과 아세트산나트륨 2.7 g을 각각 취하여 900 mL 증류수에 녹인 후 염산을 이용하여 pH 8.0으로 조절한 후 1 L로 한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질을 정밀하게 칭량하고 33 mM Tris-HCl 완충용액에 희석하고 60℃ 수욕상에서 완전히 녹인 것을 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 33 mM Tris-HCl 완충용액을 이용하여 적절히 희석한 용액을 표준용액으로 한다.

4.1.3 표준용액 50 μL에 0.002 unit/uL 콘드로이티나아제 ABC 50 μL와 33 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액 400 μL를 넣고 37℃에서 3시간 반응시킨다.

4.1.4 반응이 완료되면 100℃에서 5분간 가열하고 위의 용액을 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 히알루론산으로서 0.5∼5 mg이 함유되도록 적당량의 시료를 칭량하여 50 mL 부피플라스크 넣고 33 mM Tris-HCl 완충용액으로 정용한 후 혼합한다.

4.2.2 마그네틱 바를 넣고 60℃에서 90분간 강하게 추출 후 실온에 식힌다.

4.2.3 시료추출액 50 uL에 0.002 unit/uL 콘드로이티나아제 ABC  50 uL와 33 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액 400 uL를 넣고 37℃에서 3시간 반응시킨다.

4.2.4 반응이 완료되면 100℃에서 5분간 가열하고 용액을 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 uL
칼럼온도	40℃
이동상	0.05 M NaCl(pH 3.5)
검출기 파장	232 nm
유량	1.0 mL/min

5.2 계산

5.2.1. 히알루론산 표준용액에서 얻은 히알루론산의 피크면적으로 검량선을 작성하고, 검량선 식을 이용하여 시험용액 중의 히알루론산의 농도를 구한 후 아래 식을 이용하여 히알루론산 함량을 계산한다.

히알루론산의 함량 (mg/g)	=	A × B × C	×	378.3
		D × 1,000		401.3

A : 시험용액의 전량(mL)

B : 희석배수

C : 시험용액중의 히알루론산의 농도(μg/mL)

D : 시료 채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

378.3 : 히알루론산 이당류의 분자량

401.3 : 히알루론산 나트륨 이당류의 분자량

3-75 로사빈

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 로사빈을 메탄올 용액으로 초음파로 추출 한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 250 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 증류수와 아세토니트릴을 80 : 20으로 혼합하여 분당 1.0 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 로사빈(Rosavin)

분자식 : C20H28O10, 분자량 : 428.43, CAS No. : 84954-92-7

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile)

3.2.3 증류수(Distilled water)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질 로사빈 10 mg을 정밀히 칭량하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 메탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.1.3 위의 표준원액을 메탄올을 이용하여 적정농도로 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 100 mg을 정밀히 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 메탄올을 가하여 녹인다.

4.2.2 10분 동안 초음파로 추출 후 실온에서 냉각하여 메탄올로 정용한다.

4.2.3 위의 용액을 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	30℃
이동상	A : Distilled water B : Acetonitrile
검출기 파장	250 nm
유량	1.0 mL/min

표 2. 고속액체크로마토그래프 이동상 조성(예)

분	이동상(%)
	A(Distilled water)	B(Acetonitrile)
0	80	20
15	80	20
20	30	70
25	30	70
30	80	20
40	80	20

5.2 계산

5.2.1 로사빈 함량(mg/g) = C × (a × b)/S × (1/1,000)

C : 시험용액 중의 로사빈의 농도(ug/mL)

S : 시료 채취량(g)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

3-76 안토시아노사이드

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 안토시아노사이드를 염산을 이용하여 안토시아니딘으로 분해한 후 분광광도기로 분석하는 방법으로 540 nm의 파장으로 흡광도를 구하여 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 자외분광광도계

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 안토시아니딘의 함량이 알려진 바키늄미르틸루스엑스

3.2 일반시약

3.2.1 무수에탄올(Ethanol, anhydrous)

3.2.2 염산(Hydrochloric acid)

3.2.3 증류수(Distilled water)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 안토시아니딘의 함량이 알려진 바키늄미르틸루스엑스 약 20 mg을 정밀히 칭량하여 시험용액과 같이 조작하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 20 mg(안토시아니딘으로서)을 정밀히 칭량하여 무수에탄올·1.5 mol/L 염산혼합액(17:3)을 넣어 녹인 후 200 mL 부피플라스크에 정용한다.

4.2.2 이 액 5 mL를 취하여 무수에탄올·1.5 mol/L 염산혼합액(17:3)을 넣어 50 mL로 정용한 다음 여과하여 처음 여액 20 mL은 버리고 다음 여액을 시험용액으로 한다.

4.2.3 무수에탄올·1.5 mol/L 염산혼합액(17:3)을 대조액으로 하여 파장 540 nm에서 시험용액 및 표준용액의 흡광도 AT 및 AS를 측정한다.

5. 계산

5.1 계산

5.1.1. 총 안토시아노사이드의 함량(mg/g)

표준품의 안토시아니딘 양(mg)	×	AT	×	1.475	×	1	×	1
		AS				S		1,000

AT: 시험용액의 흡광도

AS: 표준용액의 흡광도

S : 시료 채취량(mg)

1.475: 안토시아니딘의 안토시아노사이드 전환계수

1/1,000 : 단위 환산 계수

3-77 알리인

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 알리인의 함량을 80% 메탄올 용액으로 초음파로 추출 한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 208 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 3.0 mm, 길이 150 mm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것.

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 A 용액(20 mM 인산이수소나트륨·10 mM 헵탄설폰산나트륨, pH 2.0)을 분당 0.4 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 알리인(L(+)Alliin)

분자식 : C6H11NO3S, 분자량 : 177.22, CAS No. : 556-27-4

3.2 일반시약

3.2.1 헵탄설폰산나트륨(1-Heptane sulfonic acid, sodium salt, HPLC grade)

3.2.2 인산이수소나트륨(Sodium dihydrogenphosphate, anhydrous)

3.2.3 인산(Phosphoric acid)

3.2.4 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.5 증류수(Distilled water)

3.2.6 메탄올(Methanol)

3.2.7 포름산(Formic acid)

3.3 시액의 제조

3.3.1 20 mM 인산이수소나트륨·10 mM 헵탄설폰산나트륨용액

인산이수소나트륨 약 2.4 g과 헵탄설폰산나트륨용액 약 2.0 g을 물에 녹여 1L로 정용하고 인산으로 pH 2.0로 조절한다.

3.3.2 80% methanol 용액(pH 3.0)

Methanol:D.W를 80:20(v/v)의 비율로 혼합하고 포름산을 이용하여 pH 3.0로 조절한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질 알리인 10 mg을 정밀히 칭량하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2. 80% 메탄올(pH 3.0) 용액을 넣어 표선까지 맞추어 표준원액으로 한다.

4.1.3 표준원액을 80% 메탄올(pH 3.0)용액으로 적정농도로 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 100 mg을 정밀히 칭량하여 25 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.2 적당량의 80% 메탄올(pH 3.0)용액을 넣고 잘 흔들어 녹인다.

4.2.3 10분간 초음파로 추출한다.

4.2.4 80% 메탄올(포름산으로 pH 3.0)로 25 mL가 되게 정용한다.

4.2.5 위의 용액을 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	30℃
이동상	A : 20 mM 인산이수소나트륨·10 mM 헵탄설폰산나트륨 용액(pH 2.0), B : 아세토니트릴 : 이동상 A(50:50)
검출기 파장	208 nm
유량	0.4 mL/min

표 2. 고속액체크로마토그래프 이동상 조성(예)

min	이동상(%)
	A	B
0	100	0
5	70	30
25	46	54
30	0	100
32	0	100
37	100	0
45	100	0

5.2 계산

5.2.1. 알리인 함량(mg/g)

= C × (a × b)/S

C : 시험용액 중의 알리인의 농도(mg/mL)

S : 시료 채취량(g)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수