식품의약품안전처 고시 제2016-63호

건강기능식품의 기준 및 규격

일부개정고시

2016. 6. 30.

식품의약품안전처

식품의약품안전처 고시 제2016-63호

「건강기능식품의 기준 및 규격」일부 개정고시

1. 개정 이유
｢건강기능식품의 기준 및 규격｣의 기능성 원료 확대 및 추가되는 기능성 원료의 시험법을 신설하여 건강기능식품의 건전한 유통과 산업활성화에   기여하고, 시험법을 효율적으로 개정하여 영업자 및 관계공무원의 이해를  도모하고자 함

2. 주요 내용

가. 기능성 원료별 기준 및 규격의 추가 등재[안 제 3, 2-61, 2-62, 2-63, 2-64, 2-65, 2-66, 2-67]

1) 라피노스 등 7개 기능성 원료의 기준 및 규격 신설

2) 라피노스, 분말한천, 크레아틴, 유단백가수분해물, 상황버섯추출물,  토마토추출물, 곤약감자추출물의 기준 및 규격 신설

3) 건강기능식품 기능성 원료를 확대하여 다양한 제품 생산·유통 등으로 산업활성화 도모 및 소비자의 선택 범위 확대

나. 건강기능식품 시험법 신설[안 제 4, 2-5, 2-5-6, 2-5-7, 3-78, 3-79, 3-80, 3-81]

1) 기능성 원료 추가에 따른 시험법 신설

2) 디시안디아미드, 디하이드로트리아진, 크레아틴 모노하이드레이트,    알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100), 라이코펜, 글루코실세라미드 등 6개 시험법을 신설함

다. 건강기능식품 시험법 추가 및 개선[안 제 4, 3-33, 3-73]

1) 분석 결과의 효율성을 높이기 위하여 시험법 개정

2) 인지질(아세톤불용물로서)과 폴리감마글루탐산의 시험법의 개선

3. 기타 참고사항

가. 관계법령 : ｢건강기능식품에 관한 법률｣

나. 예산조치 : 별도조치 필요 없음

다. 합    의 : 해당 사항 없음

라. 기    타

1) 행정예고(공고 제2016-106호, 2016. 3. 24. ～ 2016. 5. 23.)

2) 건강기능식품심의위원회 심의

- 기능성원료·성분 인정 및 기준·규격분과(2016. 6. 13.)

3) 규제심사

- 비규제 확인(2016. 3. 11, 3. 15)

식품의약품안전처 고시 제2016-63호

｢건강기능식품에 관한 법률｣ 제14조 및 제15조에 따른 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣(식품의약품안전처 고시 제2016-29호, 2016.4.20.)을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2016년 6월 30일

식품의약품안전처장

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

건강기능식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제 3. 2-61 라피노스를 다음과 같이 신설한다.

2-61 라피노스

1) 제조기준

(1) 원재료 : 사탕무(Beta vulgaris var. saccharifera)의 뿌리

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료에서 당밀을 추출한 후 규조토를 이용하여 여과함, 여과물을 이온크로마토그래피(Na) 후 증발 농축, 주정 으로 조결정화하여 분리, 용해, 규조토 여과, 주정으로 결정화, 분리,   감압건조(3시간), 분쇄하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 라피노스 980 mg/g 이상 함유  하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 라피노스

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.3 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.3 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 장내 유익균의 증식과 유해균의 억제에 도움을 줄 수 있음

(나) 배변활동을 원활히 하는데 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 라피노스로서 3～5 g

(3) 섭취 시 주의사항

섭취량 이상 섭취 시 설사를 유발할 수 있음

4) 시험법

(1) 라피노스 : [별표 4] 참조

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

제 3. 2-62 분말한천을 다음과 같이 신설한다.

2-62 분말한천

1) 제조기준

(1) 원재료 : 우뭇가사리(Gelidium amansil)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 1～2% 가성소다 용액으로 70℃,   1시간 동안 처리하고, 정제수로 수세(pH 9～10)하여, 산처리(황산으로 pH 6.5～7.5가 되게 중화)하여 1회 세정하고 자숙(90～100℃, 2시간) 후 추출, 퍼라이트 또는 규조토로 여과, 응고, 탈수, 세절, 건조, 분쇄하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 총 식이섬유 80.0% 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 총 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 열탕불용해잔사물(%) : 4.0 이하

(4) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 0.3 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.5 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.2 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 0.3 이하

(5) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 배변활동에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 분말한천으로서 2～5 g(총 식이섬유로서 1.6～4.0 g)

(3) 섭취 시 주의사항

(가) 어린이나 임산부, 수유부는 섭취를 주의해야 함

(나) 충분한 물과 함께 섭취해야 함

(다) 과다 섭취 시 미약한 설사, 구토, 배변량 증가, 배변빈도 증가,   복부 팽만, 두통 등의 부작용을 일으킬 수 있음

4) 시험법

(1) 총 식이섬유 : 제 4. 3-26 식이섬유 3-26-1 식이섬유(제1법) 4.2 총  식이섬유(TDF) 함량 측정

(2) 열탕불용해잔사물 : [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

제 3. 2-63 크레아틴을 다음과 같이 신설한다.

2-63 크레아틴

1) 제조기준

(1) 원재료 : Sodium sarcosinate 수용액, Cyanamide 수용액

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료 Sodium sarcosinate 수용액(20℃, 염산으로 pH 9.6 조정)과 Cyanamide 수용액을 80～85℃ 90분 동안 반응시킨 후 80℃에서 2시간 가열·교반하고 4시간 냉각하여 결정화, 감압여과하여 40℃ 증류수로 세척 후 분말 회수하여 40℃, 20mbar에서 진공 건조하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 크레아틴 모노하이드레이트 990 mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 크레아틴 모노하이드레이트

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 디시안디아미드(mg/kg) : 50.0 이하

(4) 디하이드로트리아진(mg/kg) : 불검출

(5) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.5 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.5 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(6) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 근력 운동 시에 운동수행능력 향상에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 크레아틴으로서 3 g

(3) 섭취 시 주의사항

(가) 신장에 영향을 미치는 약물을 복용하거나 신장 이상의 위험이 있는 사람은 의사와 상담 후에 섭취하여야 함

(나) 어린이, 임산부, 수유부는 섭취를 삼가

(다) 카페인은 크레아틴의 기능을 감소시킬 수 있음

(라) 크레아틴의 섭취는 탈수를 동반할 수 있으므로 충분한 물과 함께   섭취하여야 함

(마) 과다 섭취하지 말 것

4) 시험법

(1) 크레아틴 모노하이드레이트 : 제 4. 3-78 크레아틴 모노하이드레이트

(2) 디시안디아미드 : 제 4. 2-5-6 디시안디아미드

(3) 디하이드로트리아진 : 제 4. 2-5-7 디하이드로트리아진

(4) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(5) 대장균군 : [별표 4] 참조

제 3. 2-64 유단백가수분해물을 다음과 같이 신설한다.

2-64 유단백가수분해물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 탈지우유

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 원심분리하여 카제인(Casein)을 분리하고 알칼리화하여 트립신으로 가수분해(40～50℃, pH 7.5～9.0), 산성화하여 90℃ 1.5분동안 열처리한 후 분무건조(180～200℃, 공기주입)  하여 선별하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)*, (Tyr1 Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg10)을 18～27 mg/g 함유하고 있어야 함

* αS1-casein의 91～100번째 분절

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.1 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.1 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 스트레스로 인한 긴장 완화에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 유단백가수분해물로서 150 mg(알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)으로서 2.7～4.1 mg)

(3) 섭취 시 주의사항

(가) 임산부, 수유여성 및 어린이는 섭취에 주의

(나) 우유 및 유제품에 대하여 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의

4) 시험법

(1) 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100) : 제 4. 3-79 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

제 3. 2-65 상황버섯추출물을 다음과 같이 신설한다.

2-65 상황버섯추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 상황버섯(Phellinus linteus, 3～4년생 건조물)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 3 mm이하로 분쇄하여 버섯함량의 약 10배수의 물을 투입하여 110℃, 96～100시간 추출하여 고압을 통해압착 여과하여 건조(75～80℃, 열풍건조)한 후 분쇄하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 베타글루칸(β-glucan)을 87～162 mg/g 함유하고 있어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 원재료인 상황버섯(Phellinus linteus, 3～4년생 건조물)은 I T S- 5.8S rDNA sequence 분석에 의하여 Phellinus linteus 종으로 확인된 종균을 사용하고, 외부로부터 미생물 오염을 차단할 수 있는 용기에 영양분을 갖춘 고형배지를 넣고 살균한 후 버섯종균을 접종하고 3～4년간 재배하여, 포자 형성이 확인된 흑갈색의 자실체 형태로 성장한 상황버섯을 채취하여야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 베타글루칸(β-glucan)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.4 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.3 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 면역기능 개선에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 상황버섯추출물로서 3.3 g(베타글루칸(β-glucan)으로서 287.1～534.6 mg)

4) 시험법

(1) 베타글루칸 : 제 4. 3-25 베타글루칸

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

제 3. 2-66 토마토추출물을 다음과 같이 신설한다.

2-66 토마토추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 토마토(Lycopersicon esculentum)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 분쇄하여 체로 쳐서 사별하여 원심 분리(75～110℃, 2,600～4,000g)한 후 토마토 펄프를 초산에틸로 추출 하여 용매를 제거한 후 표준화하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : all-trans-라이코펜을 40～80 mg/g 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) all-trans-라이코펜

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 1.0 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

(5) 잔류용매(mg/kg) : 50.0 이하(초산에틸을 사용한 경우)

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 항산화에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : all-trans-라이코펜으로서 5.7～15 mg

(3) 섭취 시 주의사항

(가) 알레르기 체질이신 분은 개인에 따라 과민반응을 나타낼 수 있음

(나) 과량 섭취 시 피부색이 오렌지색으로 변할 수 있음

(다) 임산부, 수유 여성 및 어린이는 섭취에 주의

4) 시험법

(1) all-trans-라이코펜 : 제 4. 3-80 라이코펜

(2) 잔류용매 : [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

제 3. 2-67 곤약감자추출물을 다음과 같이 신설한다.

2-67 곤약감자추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 곤약감자(Amorphophallus konjac)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료에서 곤약(글루코만난)을 제조하고   남은 부산물을 주정(3,000L)으로 교반추출하여 감압농축한 후 주정 정제(주정 30L, 정제수 100L 투입) 교반함, 식염 5 kg을 투입하여 지질성분만 회수하여 진공 농축 후 30(추출물) : 70(베타-시클로덱스트린)의 비율로 베타-시클로덱스트린을 혼합하여 건조, 분쇄하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 글루코실세라미드(Glucosylceramide) 22.5～34 mg/g 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 2.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 1.0 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 피부 보습에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 글루코실세라미드(Glucosylceramide)로서 1.2～1.8 mg

(3) 섭취 시 주의사항

임산부와 수유기 여성은 섭취를 피할 것

4) 시험법

(1) 글루코실세라미드 : 제 4. 3-81 글루코실세라미드

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

[별표 4]를 다음과 같이 한다.

[별표 4] 시험법 적용표

시험항목	적용규정	시험방법	비고
수분	식품의 기준 및 규격 (식품공전)	제9. 일반시험법 1.1.1 수분 ※ Ⅱ.2.7.1 로얄젤리는 1.1.1.3 칼피셔법에 따름
회분		제9. 일반시험법 1.1.2 회분
조지방		제9. 일반시험법 1.1.5.1 조지방
산가		제9. 일반시험법 1.1.5.3.1 산가
과산화물가		제9. 일반시험법 1.1.5.3.5 과산화물가
환원당		제9. 일반시험법 1.1.4.1.2 환원당
타르색소		제9. 일반시험법 2.4 착색료
납		제9. 일반시험법 7.1 중금속 시험
카드뮴		제9. 일반시험법 7.1 중금속 시험
총수은		제9. 일반시험법 7.1 중금속 시험
총비소		제9. 일반시험법 7.1 중금속 시험
세균수		제9. 일반시험법 3.5 세균수
대장균군		제9. 일반시험법 3.7 대장균군
대장균		제9. 일반시험법 3.8 대장균
살모넬라		제9. 일반시험법 3.11 살모넬라
세균발육		제9. 일반시험법 3.6 세균발육시험
테트라싸이클린 클로르테트라싸이클린		제9. 일반시험법 5.3.49 옥시테트라싸이클린, 클로르테트라 싸이클린, 테트라싸이클린, 독시싸이클린
총 아플라톡신		제9. 일반시험법 6.1.1 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2)
포도당당량(D.E.)		제5. 식품별 기준 및 규격 6. 포도당 6) 시험방법 (1) 포도당당량(D.E.)
라피노스		제5. 식품별 기준 및 규격 10. 올리고당류 6) 시험방법 (1) 올리고당 ④ 갈락토올리고당(라피노스, 스타치오스)
열탕불용해잔사물		제5. 식품별 기준 및 규격 29. 기타식품류 29-25 한천 6) 시험방법 (5) 열탕불용해잔사물
잔류용매 (초산에틸)	건강기능식품의 기준 및 규격 (건강기능 식품공전)	제4. 건강기능식품 시험법 2, 2-5, 2-5-5 초산에틸
잔류용매	식품첨가물의 기준 및 규격 (식품첨가물공전)	제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 80. 파프리카추출색소
잔류용매 (이소프로필알콜)		제4. 품목별 규격 및 기준 나. 천연첨가물 108. 글루코만난

제 4. 2. 2-5 2-5-6 디시안디아미드(Dicyandiamide)을 다음과 같이 신설한다.

2-5-6 디시안디아미드(Dicyandiamide)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 디시안디아미드를 증류수에 용해한 후 초음파  추출하고 최대흡수파장인 212 nm와 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도 검출기(UV Detector)

2.2.3 양이온 교환 컬럼 Nucleosil 100-5 SA (안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 디시안디아미드(Dicyandiamide)

분자식 : C2H4N4, 분자량 : 84.08, Cas No. : 461-58-5

3.2 일반시약

3.2.1.인산이수소암모늄(Ammonium dihydrogen phosphate, HPLC grade)

3.2.2 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.2.3 증류수

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 100 mL 부피플라스크에 디시안디아미드 100 mg을 정밀하게 달아 증류수를 가하여 정용하여 이를 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 증류수로 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 1 g을 정밀히 달아 10 mL 부피플라스크에 넣고, 증류수 7 mL을 넣는다.

4.2.2 시료를 잘 흔들어 녹인 후, 2분간 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 실온에서 냉각하여 증류수로 10 mL 정용한다.

4.2.4 위의 시험용액을 증류수로 적정농도(μg/mL)로 희석한 후, 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35 ℃
이동상	2.3%(w/v) 인산이수소암모늄 (pH 5.5)
검출기 파장	212 nm
유속	0.5 mL/min

5.2 계산

5.2.1 표준용액 및 시험용액 10 μL를 주입하여 앞의 조건에 따라 시험한다. 표준용액 중 디시안디아미드 면적에 의해 구한 검량선에 따라  시험용액 중 디시안디아미드 농도를 구하고 다음 식에 따라 디시안디아미드 함량을 구한다.

디시안디아미드 함량(mg/kg)	=	C	×	a	×	b
				S

C : 시험용액 중 디시안디아미드 함량(μg/mL)

a : 시험용액 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 무게(g)

제 4. 2. 2-5 2-5-7 디하이드로트리아진(Dihydrotriazine)을 다음과 같이  신설한다.

2-5-7 디하이드로트리아진(Dihydrotriazine)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 디하이드로트리아진을 증류수에 용해한 후 초음파 추출하고 최대흡수파장인 237 nm에서 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도 검출기(UV Detector)

2.2.3 양이온 교환 컬럼 Nucleosil 100-5 SA (안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 디하이드로트리아진(Dihydro-1,3,5-triazine)

분자식 : C3H5N3, 분자량 : 83.09, CAS No. : 45427-50-7

3.2 일반시약

3.2.1 인산이수소암모늄(Ammonium dihydrogen phosphate, HPLC grade)

3.2.2 수산화나트륨 (Sodium hydroxide)

3.2.2 증류수

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 100 mL 부피플라스크에 디하이드로트리아진 100 mg을 정밀하게 달아 증류수를 가하여 정용하여 이를 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 증류수로 희석하여 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5 μg/mL 농도로 표준용액을 만들어 사용한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 1 g을 정밀히 달아 10 mL 부피플라스크에 넣고, 증류수 7 mL을 넣는다.

4.2.2 시료를 잘 흔들어 녹인 후, 2분간 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 실온에서 냉각하여 증류수로 10 mL 정용한다.

4.2.4 위의 시험용액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액  으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35℃
이동상	2.3%(w/v) 인산이수소암모늄(pH 5.5)
검출기 파장	237 nm
유속	0.5 mL/min

5.2 계산

5.2.1 표준용액 및 시험용액 10 μL를 주입하여 앞의 조건에 따라 시험한다. 표준용액 중 디하이드로트리아진 면적에 의해 구한 검량선에 따라 시험용액 중 디하이드로트리아진 농도를 구하고 다음 식에 따라 디하이드로트리아진 함량을 구한다.

디하이드로트리아진 함량(mg/kg)	=	C	×	a	×	b
				S

C : 시험용액 중 디하이드로트리아진 함량(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 무게(g)

제 4. 3. 3-33을 다음과 같이 한다.

3-33 인지질(아세톤불용물로서)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 지질을 충분히 추출하여 지질의 양을 측정하고  이들 지질 중 인지질을 아세톤 불용물로서 분리하여 무게를 측정하여 인지질 함량을 정량 분석하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 둥근바닥플라스크

2.1.2 원심분리관(50 mL)

2.1.3 감압농축기

2.1.4 건조기(Dry oven)

2.1.5 원심분리기

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 일반시약

3.1.1 석유에테르

3.1.2 에틸에테르

3.1.3 헥산

3.1.4 아세톤(Acetone, 0～5℃로 냉각)

4. 시험과정

4.1 시료 약 2 g(W1, 수분을 함유한 경우 미리 80℃ 전후로 가온하여 감압하에 탈수 건조한다)을 석유에테르, 헥산 등으로 용해한 후 여과한다. 캡슐제품의 경우 중앙을 절단한 후 삼각플라스크에 넣고 에틸에테르 약 40 mL를 넣어 10분간 진탕시켜 내용물을 완전히 용해 추출시키고 캡슐 기제를 제거하여 여과한다.

4.2 지질 이외의 성분이 제거된 여액은 미리 항량한 둥근바닥플라스크에 넣어 잔존하는 용제를 감압하에 제거하여 자연건조 후 시험용 시료(W2)로 한다.

※ 지질이외의 성분 제거 조작 시 클로로포름/메탄올, 클로로포름/  헥산 등의 혼합액을 사용하여 환류할 수 있다.

4.3 시험용 시료(W2)를 석유에테르 3mL에 녹여 50 mL 눈금의 원심분리관에 넣고 아세톤 15 mL를 가해 잘 혼합하고 얼음물 중에 15분간  방치한다.

4.4 이에 미리 0～5℃로 냉각한 아세톤을 가해 50 mL로 하여 다시 얼음물 중에 15분간 방치한 다음 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 미리 항량한 플라스크에 취한다.

4.5 원심분리관의 침전물에 0～5℃의 아세톤을 가해 50 mL로 하고, 얼음 중에서 냉각시키면서 잘 혼합한 후 4.4와 동일하게 원심분리하여 상층액을 4.4의 플라스크에 합하여 수욕 상에서 감압농축한다.

4.6 잔류물은 105℃에서 한 시간 건조 후 함량을 구한다(W3)

5. 분석 및 계산

5.1 인지질 함량(mg/g) = (W2 -W3)/W1

W1 : 시료 채취량(g)

W2 : 시험용 시료량(mg)

W3 : 아세톤 가용물 중량(mg)

제 4. 3. 3-73을 다음과 같이 한다.

3-73 폴리감마글루탐산

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 폴리감마글루탐산을 산으로 가수분해한 후 아미 노산 자동분석기 또는 고속액체크로마토그래피/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정량 분석하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크 (50 mL, 100 mL)

2.1.2 시험관 (4 mL, 40 mL)

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인 필터

2.1.5 액체크로마토그래피용 유리병

2.1.6 건조기(Dry oven)

2.1.7 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 아미노산 자동분석기

2.2.1.1 이온 교환 칼럼으로 HR NA 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 200 mm, 유리아미노산 분석용) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래피

2.2.2.1 질량검출기 (Mass Selective Detector)

2.2.2.2 옥타데실실릴화한 칼럼 (C18, 안지름 2.1 mm, 길이 50 mm, 충진입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

아미노산 자동분석기를 사용하는 경우, 완충액, 발색시약의 유무, 칼럼항온조의 온도를 점검하고, 자동완충액 전환기구 및 정유량 펌프,   유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실시한다.

2.3.1 아미노산 자동분석기 관련 시약

2.3.1.1 닌히드린시약(Ninhydrin reagent, 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

2.3.1.2 구연산리튬완충액(Lithium citrate buffer, 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

2.3.1.3 완충액(기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 L-글루탐산(L-glutamic acid)

분자식 : C5H9NO4, 분자량 : 147.13, CAS No. : 56-86-0

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.2 개미산(Formic acid, HPLC grade)

3.2.3 염산(Hydrochloric acid, HPLC grade)

3.2.4 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol, HPLC grade)

3.2.5 증류수

3.3 시액의 제조

3.3.1 6 N 염산

3.3.2 0.02 N 염산

3.3.3 0.05% 2-머캅토에탄올 함유 6 N 염산

4. 시험과정

4.1 표준용액의 제조

4.1.1 L-글루탐산 표준품 10 mg을 정밀하게 칭량하여 100 mL 부피  플라스크에 취한 후 0.02 N 염산을 가하여 정용한다.

4.1.2 위의 표준원액을 0.02 N 염산으로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 시험용액의 제조

4.2.1 총 글루탐산

4.2.1.1 시료 20 mg을 4 mL 시험관에 정밀히 취한다.

※ 폴리감마글루탐산이 함유된 최종제품(A) 및 폴리감마글루탐산이 미함유된 최종제품(B)을 각각 실험한다.

4.2.1.2 마개가 달린 40 mL 시험관에 0.05% 2-머캅토에탄올 함유 6 N 염산 용액 200 μL를 첨가한 후, 시료를 취한 4 mL 시험관을 넣고 마개를 닫는다.

4.2.1.3 건조기에서 105-110℃, 22-24시간 동안 가수분해한다.

4.2.1.4 가수분해 된 4 mL 시험관 안의 시료를 0.02 N 염산을 이용  하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴다.

4.2.1.5 30분 동안 초음파 추출한다.

4.2.1.6 위의 용액을 실온에서 냉각하고 0.02 N 염산으로 100 mL 정용한다.

4.2.1.7 위의 시험용액을 0.02 N 염산으로 적절히 희석한 후 0.2 μm  멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4.2.1.8 시험용액을 아미노산 자동분석기 또는 고속액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기로 분석하여 총 글루탐산 함량을 구한다.

4.2.2 유리 글루탐산

4.2.2.1 시료 1 g을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 0.02 N 염산을 가하여 시료를 녹인다.

※ 폴리감마글루탐산이 함유된 최종제품(A) 및 폴리감마글루탐산이 미함유된 최종제품(B)을 각각 실험한다.

4.2.2.2 30분 동안 초음파 추출한다.

4.2.2.3 위의 용액을 실온에서 냉각하고 0.02 N 염산으로 50 mL 정용한다.

4.2.2.4 위의 시험용액을 0.02 N 염산으로 적절히 희석한 후 0.2 μm  멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4.2.2.5 시험용액을 아미노산 자동분석기 또는 고속액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기로 분석하여 유리 글루탐산 함량을   구한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

5.1.1 아미노산 자동분석기

표 1. 아미노산 자동분석기조건(예)

항목	조건
주입량	20 uL
칼럼온도	38∼78℃
흡광검출기 파장	570 nm
완충액	0.35 mL/min
반응액	닌히드린 시약 : 0.30 mL/min
반응기온도	135℃

5.1.2 고속액체크로마토그래피/질량검출기/질량검출기

표 2. 고속액체크로마토그래피/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목	조건
이동상	A용액 : 0.1% 개미산 B용액 : 메탄올
칼럼온도	35℃
유속	0.4 mL/min
주입량	1 μL
이온화	ESI, Positive
분석모드	MRM
Capillary voltage	4.0 kV
Corn voltage	20 V
Desolvation temperature	350℃
Monitor ions(m/z)	148(precursor), 84, 130(product)

표 3. 고속액체크로마토그래피/질량검출기/질량검출기 이동상 조건(예)

시간(분)	이 동 상 (%)
	A 용액 (%)	B 용액 (%)
0	98	2
2	98	2
3	5	95
4	5	95
4.1	95	5
5	95	5

5.2 계산

5.2.1 폴리글루탐산 함량(mg/g) = 폴리감마글루탐산이 함유된 최종제품에서의 폴리감마글루탐산 함량(A) - 폴리감마글루탐산이 미함유된 최종제품에서의 폴리감마글루탐산의 함량(B)

※ A 및 B에서의 폴리감마글루탐산의 함량(mg/g) : (총 글루탐산 함량 × 0.88) - 유리글루탐산 함량

* 총 글루탐산 함량(mg/g) = (H × V × D)/(S × 1,000)

H : 시험용액의 총 글루탐산 농도(μg/mL)

V : 시험용액 전량(mL)

D : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

* 유리 글루탐산 함량(mg/g) = (C × V × D)/(S × 1,000)

C : 시험용액의 유리 글루탐산 농도(μg/mL)

V : 시험용액 전량(mL)

D : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

* 0.88 = 129 (폴리글루탐산 중 글루탐산 잔기의 분자량) / 147 (글루탐산 분자량)

제 4. 3. 3-78 크레아틴 모노하이드레이트를 다음과 같이 신설한다.

3-78 크레아틴 모노하이드레이트

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 크레아틴 모노하이드레이트를 증류수에 용해한 후 초음파 추출하고 최대흡수파장인 224 nm에서 고속액체크로마토그래프/  자외부흡광광도검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래피용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기(UV Detector)

2.2.3 양이온 교환 컬럼 Nucleosil 100-5 SA(4.6×250 mm) 또는 이와

동등한 것(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 또는

이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 크레아틴 모노하이드레이트 (Creatine monohydrate(2-(methylguanidino) ethanoic

acid))

분자식 : C4H9N3O2․H2O, 분자량 : 149.15, CAS No. : 6020-87-7

3.2 일반시약

3.2.1 인산이수소암모늄 (Ammonium dihydrogen phosphate, HPLC grade)

3.2.2 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.2.3 증류수

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 100 mL 부피플라스크에 크레아틴 모노하이드레이트 100 mg을

정밀하게 달아 증류수를 가하여 정용하여 이를 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 증류수로 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 크레아틴 모노하이드레이트로서 10～40 mg이 함유되도록 적당량의 시료를 달아 100 mL 부피 플라스크에 넣고 증류수를 70 mL 넣는다.

4.2.2 시료를 잘 흔들어 녹인 후 2분간 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 실온에서 냉각하여 증류수로 100 mL 정용한다.

4.2.4 위의 시험용액을 증류수로 적정농도(μg/mL)로 희석한 후, 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35 ℃
이동상	2.3%(w/v) 인산이수소암모늄(pH 5.5)
검출기 파장	224 nm
유속	0.5 mL/min

표 1. 고속액체크로마토그래피 조건(예)

5.2 계산

5.2.1 크레아틴 모노하이드레이트 표준용액의 피크면적으로 검량선을 작성하고, 검량선식을 이용하여 시험용액 중의 크레아틴 모노하이드레이트 농도를 구한 후 아래 식을 이용하여 크레아틴 모노하이드레이트 함량을 계산한다.

크레아틴 모노하이드레이트 함량(mg/g)	=	C	×	a	×	b
				S

C : 시험용액 중 크레아틴 모노하이드레이트의 농도(μg/mL)

a : 시험용액 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료무게(mg)

제 4. 3. 3-79 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)을 다음과 같이 신설한다.

3-79 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료로부터 추출한 알파에스1카제인(f91-100)을 고속액체크로마토그래프 분석하는 방법으로 자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL)

2.1.2 HPLC용 유리병

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인 필터(PTFE, 0.45 μm)

2.1.5 교반기

2.2 분석 장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부 흡광 광도 검출기(UV Detector)

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Decapeptide(Synthetic αS1-casein(f91-100))

분자식 : C60H94N14O16 분자량 : 1267.50

3.2 일반시약

3.2.1 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)

3.2.2 증류수

3.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 Synthetic 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100) 표준물질을 5 mg ∼ 100 mg을 정밀히 측정하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 이동상 A, B가 혼합된 용액 (74:26 (v:v))으로 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.3 위의 용액을 적절히 단계별 희석하여 표준용액으로 한다.

4.1.4 30 분간 교반한 후 표준원액을 적절히 희석(예; 1:20)하여 검량선 작성용 표준용액을 조제한다.

4.1.5 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 원료 약 20 mg (±0.1 mg)을 50 mL의 용기에 취하여 이동상 A, B가 혼합된 용액 (74:26 (v:v))으로 녹인다.

4.2.2 유단백가수분해물로서 2 mg/mL의 농도가 되도록 한다.

4.2.3 30 분간 교반한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	100 μL
칼럼온도	37℃
이동상	A 용매 – 0.1% 트리플루오로아세트산용액 B 용매 – 0.1% 삼불화초산이 포함된 아세토니트릴
유량	0.8 mL/min
검출기 파장	280 nm

표 2. 이동상 조건(예)

시간 (분)	용매
	A (%)	B (%)
0	74	26
20.0	66	34
20.1	1	99
25.0	1	99
25.1	74	26
34.0	74	26

5.2 계산

알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100) 함량 (mg/g) = A × B × C / S

A : 시험용액 중 αS1-casein(f91-100)의 농도(mg/mL)

B : 시험용액의 전량(mL)

C : 표준품 순도

S : 시료채취량 (g)

제 4. 3. 3-80 라이코펜(lycopene)을 다음과 같이 신설한다.

3-80 라이코펜(lycopene)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 염화메틸렌을 이용하여 시료 중 all-trans-라이코펜을 추출하고 고속액체크로마토그래피/자외부 흡광광도 검출기를 이용하여 정량  분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50mL, 100mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래피용 유리병

2.1.4 용매용 일회용 실린지

2.1.5 초음파 진탕기

2.1.6 시험관

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래피

2.2.2 분광광도계

2.2.3 자외부 흡광광도 검출기

2.2.4 옥타데실실릴화한 컬럼(4.6×250 mm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 all-trans-lycopene(Ψ,Ψ-carotene,2,6,10,14,19,23,27,31-Octamethyl

-dotriaconta-2,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,30-tridecaene)

분자식 : C40H56, 분자량 : 536.87, CAS No. : 502-65-8

3.2 일반시약

3.2.1 부틸히드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene, HPLC grade)

3.2.2 디이소프로필에틸아민(Diisopropylethylamine)

3.2.3 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.4 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.5 염화메틸렌(Dichlromethane, HPLC grade)

3.2.6 헥산(n-Hexane, HPLC grade)

4. 시험과정

4.1 부틸히드록시톨루엔시액 조제

4.1.1 500 mL의 용량플라스크에 부틸히드록시톨루엔 2.5 g을 넣고 염화메틸렌으로 정용한다. 빛을 차단하여 4℃에 보관할 경우 3개월  까지 사용이 가능하다.

4.2 희석액 조제

4.2.1 1 L의 용량플라스크에 아세토니트릴, 메탄올, 염화메틸렌, 헥산 및 부틸히드록시톨루엔 시액을 각 600:150:150:100:0.5(v/v%) 비율로 혼합하고 디이소프로필에틸아민을 0.05%가 되도록 가하여 잘   섞은 후 3～4분간 초음파를 통과시킨다.

4.3 표준원액의 조제(A 용액)

4.3.1 100 mL의 용량플라스크에 표준물질이 6～8 mg이 되도록 취하고 염화메틸렌 10 mL을 가하여 초음파를 통과시켜 용해한 후, 라이코펜 농도가 0.07 mg/mL이 되도록 희석액으로 희석하여 사용  한다.

4.4 표준용액의 조제(B 용액)

4.4.1 100 mL의 용량플라스크에 표준원액 A 2 mL를 취하고 알코올과 부틸히드록시톨루엔 시액 1:1(v/v%)로 섞은 액을 20mL를 가한 후 n-헥산으로 정용한다.

4.4.2 분광광도계 472 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.4.3 위의 과정을 3회 반복 측정값의 평균값을 흡광도값이라 한다.

4.4.4

표준원액(A용액)의 라이코펜 함량(μg/mL)	=	Aχ×B×10,000
		3,450

Aχ : 표준용액 B의 흡광도

B : 희석배수(표준용액 B의 최종 정용량/표준원액 A 채취량)(50)

10,000 : 단위환산계수

3,450 : UV 472 ㎚ 에서 헥산 내의 순수 all-trans-라이코펜의 흡광도

4.5 시험용액의 조제

4.5.1 시료를 50℃의 항온수조에서 데우고 유봉 또는 스파튤라를 이용하여 잘 섞는다.

4.5.2 시료 약 1g을 정량하여 100 mL 부피플라스크에 넣고 부틸히드록시톨루엔 시액 10 mL와 염화메틸렌 30 mL을 넣는다.

4.5.3 시료를 잘 흔들어 추출한 후 초음파진탕기로 1분간 더 추출한다.

4.5.4 이 혼합액을 5 mL 취해서 50 mL의 용량 플라스크에 넣은 후,

표시선까지 희석액을 채워서 희석한다.

4.5.5 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 용액을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40℃
이동상	아세토니트릴 : 메탄올 : 염화메틸렌 : 헥산 : 디이소프로필에틸아민 = (475 : 475 : 25 : 25 : 0.05, v/v)
유속	0.6 mL/min
검출기 파장	472 nm

5.2 계산

5.2.1 표준원액(A용액)을 적절히 희석한 표준용액과 시험용액 동량(10 μL)을

액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을

비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 라이코펜의

함량을 구한다.

all-trans-라이코펜 함량(mg/g)	=	A×B×C
		D×1,000

A : 시험용액의 전량(mL)

B : 희석배수

C : 시험용액중의 all-trans-라이코펜의 농도(μg/mL)

D : 시료 채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

제 4. 3. 3-81 글루코실세라미드(Glucosylceramide)을 다음과 같이 신설

한다.

3-81 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료로부터 추출한 글루코실세라미드(Glucosylceramide)를 고속액체크로마토그래프 분석하는 방법으로 ELSD(Evaporative Light Scattering Detector) 검출기를 이용하여  정성 및 정량분석을 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(10 mL)

2.1.2 삼각플라스크(100 mL)

2.1.3 분액여두(200 mL)

2.1.4 0.45 μm 멤브레인 필터

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 Inertsil 100A (3.0×150mm, 5um, GL science) 또는 이와 동등한 것

2.2.3 증기화 광산란 검출기(ELSD, Evaporative Light Scattering Detector)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

3.2 일반시약

3.2.1 클로로포름(Chloroform, HPLC grade)

3.2.2 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.3 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.4 증류수

4. 시험과정

4.1 표준용액

4.1.1 10 mL 용량플라스크에 글루코실세라미드 표준물질 10mg을 정밀하게 달아 클로로포름:메탄올=9:1 혼합액 일정량을 넣어 초음파  처리하여 방냉 후 정용한 것(1.0 mg/mL)을 표준원액이라 한다.  표준원액을 적절히 희석하여 0.1, 검량선 작성용 표준 용액을 조제한다.

4.2 시험용액

4.2.1 100 mL 삼각플라스크에 시료 약 1 g을 취한 후 0.4 N 메탄올성 KOH 용액 50 mL을 첨가하여 상온에서 2시간 교반하여 알칼리 처리를 한다.

4.2.2 200 mL 분액여두에 알칼리 처리액을 옮긴 후 증류수 40 mL로 삼각 플라스크를 세척하여 분액여두에 옮긴 후 다시 클로로포름 45 mL로 삼각플라스크를 세척하여 분액여두로 옮긴다.

4.2.3 분액여두를 약 10분간 진탕한 후 정치시켜 층을 분리시킨 후   클로로포름층을 취한다.

4.2.4 위 클로로포름 추출과정을 2회 반복하여 회수된 클로로포름층을 합한다.

4.2.5 클로로포름을 감압 농축을 통하여 농축한다.

4.2.6 농축된 잔류물을 클로로포름:메탄올=9:1 혼합액에 용해시켜     20 mL로 정용한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
시료주입량	10 μL
가스 유량	2 L/min
칼럼온도	37℃
이동상	A 용액 - 클로로포름 .B 용액 - 클로로포름:메탄올=1:1 혼합액
유속	0.6 mL/min
검출기 drift tube 온도	70℃

시간(분)	A 용액(%)	B 용액(%)
0	99	1
5	97	3
10	35	65
22	1	99
27	99	1

표 2. 이동상 조건

5.2 계산

5.2.1 표준용액 및 시험용액 동일한 양을 주입하여 앞의 시험조작에 따라 시험하여 다음과 같이 글루코실세라미드 함량을 구한다.

글루코실세라미드 함량 (mg/g)	=	시험용액의 농도(mg/mL)	×	시험용액의 전량 (mL)	×	1,000
				시료채취량 (mg)

부칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다. 다만, 제 3. 개별기준 및 규격 2-61 라피노스, 2-62 분말한천, 2-63 크레아틴, 2-64 유단백  가수분해물, 2-65 상황버섯추출물, 2-66 토마토추출물, 2-67 곤약감자 추출물, 제 4. 건강기능식품 시험법 2-5-6 디시안디아미드, 2-5-7 디하이드로트리아진, 3-78 크레아틴 모노하이드레이트,  3-79 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100), 3-80 라이코펜, 3-81 글루코실세라미드는 고시한 날부터 1년 후 시행한다

제2조(적용례) 이 고시는 이 고시 시행 이후 최초로 제조·가공 또는 수입한 건강기능식품(원료를 포함한다)부터 적용한다.

제3조(경과조치) ① 이 고시 시행 당시 검사가 접수되어 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정에 따른다.

② 이 고시 시행 당시 종전의 규정에 따라 제조․가공․수입(선적일을   기준으로 한다)한 건강기능식품은 종전의 규정에 따른다. 이 경우 해당 건강기능식품은 그 유통기한까지 판매할 수 있다.

신․구조문대비표

현  행

개 정 안

제 1. 총칙

(생  략)

제 1. 총칙

(현행과 같음)

제 2. 공통 기준 및 규격

(생  략)

제 1. 공통 기준 및 규격

(현행과 같음)

제 3. 개별 기준 및 규격

1. 영양소

1-1 ～ 1-28 (생  략)

2. 기능성 원료

2-1 ～ 2-60 (생  략)

제 3. 개별 기준 및 규격

1. 영양소

1-1～1-28 (현행과 같음)

2. 기능성 원료

2-1 ～ 2-60 (현행과 같음)

<신  설>

2-67 라피노스

1) 제조기준

(1) 원재료 : 사탕무(Beta vulgaris var. saccharifera)의 뿌리

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료에서 당밀을 추출한 후 규조토를 이용하여 여과함, 여과물을 이온크로마토그래피(Na) 후 증발 농축, 주정으로 조결정화하여 분리, 용해, 규조토 여과, 주정으로 결정화, 분리,  감압건조(3시간), 분쇄하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 라피노스 980 mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 라피노스

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.3 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.3 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용

(가) 장내 유익균의 증식과 유해균의 억제에 도움을 줄 수 있음

(나) 배변활동을 원활히 하는데 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 라피노스로서 3～5 g

(3) 섭취 시 주의사항

섭취량 이상 섭취 시 설사를   유발할 수 있음

4) 시험법

(1) 라피노스 : [별표 4] 참조

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

<신  설>

2-62 분말한천

1) 제조기준

(1) 원재료 : 우뭇가사리(Gelidium amansil)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 1～2% 가성소다 용액으로  70℃, 1시간동안 처리하고,  정제수로 수세(pH 9～10)하여, 산처리(황산으로 pH 6.5～7.5가 되게 중화)하여 1회 세정하고 자숙(90～100℃, 2시간) 후  추출, 퍼라이트 또는 규조토로 여과, 응고, 탈수, 세절, 건조, 분쇄하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 총 식이섬유 80.0% 이상   함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 총 식이섬유

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 열탕불용해잔사물(%) : 4.0 이하

(4) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 0.3 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.5 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.2 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 0.3 이하

(5) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 배변활동에   도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 분말한천으로서2～5 g(총 식이섬유로서 1.6～4 g)

(3) 섭취 시 주의사항

(가) 어린이나 임산부, 수유부는 섭취를 주의해야 함

(나) 충분한 물과 함께 섭취해야 함

(다) 과다 섭취 시 미약한 설사, 구토, 배변량 증가, 배변빈도 증가, 복부 팽만, 두통 등의 부작용을 일으킬 수 있음

4) 시험법

(1) 총 식이섬유 : 제 4. 3-26 식이섬유 3-26-1 4.2 총 식이섬유(TDF) 함량 측정

(2) 열탕불용해잔사물 : [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

<신  설>

2-63 크레아틴

1) 제조기준

(1) 원재료 : Sodium sarcosinate 수용액, Cyanamide 수용액

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료 Sodium sarcosinate 수용액(20℃, 염산으로 pH 9.6 조정)과 Cyanamide 수용액을 80～85℃ 90분동안 반응시킨 후 80℃에서 2시간 가열·교반하고 4시간 냉각하여 결정화, 감압여과하여 40℃ 증류수로 세척 후 분말 회수하여 40℃, 20mbar에서 진공 건조하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 크레아틴 모노하이드레이트 990 mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 크레아틴 모노하이드레이트

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 디시안디아미드(mg/kg) : 50.0 이하

(4) 디하이드로트리아진(mg/kg) : 불검출

(5) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.5 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.5 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(6) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 근력 운동 시에 운동수행능력 향상에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 크레아틴으로서 3 g

(3) 섭취 시 주의사항

(가) 신장에 영향을 미치는 약물을 복용하거나 신장 이상의 위험이 있는 사람은 의사와 상담 후에 섭취하여야 함

(나) 어린이, 임산부, 수유부는 섭취를 삼가

(다) 카페인은 크레아틴의 기능을 감소시킬 수 있음

(라) 크레아틴의 섭취는 탈수를 동반할 수 있으므로 충분한 물과 함께 섭취하여야 함

(마) 과다 섭취하지 말 것

4) 시험법

(1) 크레아틴 모노하이드레이트 : 제 4. 3-88 크레아틴 모노하이드레이트

(2) 디시안디아미드 : 제 4. 2-5-6 디시안디아미드

(3) 디하이드로트리아진 : 제 4. 2-5-7 디하이드로트리아진

(4) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(5) 대장균군 : [별표 4] 참조

<신  설>

2-64 유단백가수분해물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 탈지우유

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 원심분리하여 카제인(Casein)을 분리하고 알칼리화하여 트립신으로 가수분해(40～50℃, pH 7.5～9.0), 산성화하여 90℃ 1.5분동안 열처리한 후 분무건조(180～200℃ 공기주입)하여 선별하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : αS1-casein(f91-100)(Tyr1 Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg10)을 18～27 mg/g 함유하고 있어야 함

* αS1-casein의 91～100번째 분절

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) αS1-casein(f91-100)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.1 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.1 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 스트레스로 인한 긴장 완화에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 유단백가수분해물로서 150 mg(알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)으로서 2.7～4.1 mg)

(3) 섭취 시 주의사항

(가) 임산부, 수유여성 및 어린이는 섭취에 주의

(나) 우유 및 유제품에 대하여 알레르기를 나타내는 사람은 섭취에 주의

4) 시험법

(1) 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100) : 제 4. 3-79 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

<신  설>

2-65 상황버섯추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 상황버섯(Phellinus linteus, 3～4년생 건조물)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 3 mm이하로 분쇄하여 버섯함량의 약 10배수의 물을 투입하여 110℃, 96～100시간 추출하여 고압을 통해 압착 여과하여  건조(75～80℃, 열풍건조)한 후 분쇄하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 베타글루칸(β-glucan)을 87～162 mg/g 이상 함유하고 있어야 함

(4) 제조 시 유의사항 : 원재료인 상황버섯(Phellinus linteus, 3～4년생 건조물)은 I T S- 5.8S rDNA sequence 분석에 의하여 Phellinus linteus 종으로 확인된 종균을 사용하고, 외부로부터 미생물 오염을 차단할 수 있는 용기에 영양분을 갖춘 고형배지를 넣고 살균한 후 버섯종균을 접종하고 3～4년간 재배하여, 포자 형성이 확인된 흑갈색의 자실체 형태로 성장한 상황버섯을 채취하여야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 베타글루칸(β-glucan)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 0.4 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.3 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 면역기능 개선에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 상황버섯추출물로서 3.3 g(베타글루칸(β-glucan)으로서 287.1～534.6 mg)

4) 시험법

(1) 베타글루칸 : 제 4. 3-25 베타글루칸

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

<신  설>

2-66 토마토추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 토마토(Lycopersicon esculentum)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 분쇄하여 체로 쳐서 사별하여 원심 분리(75～110℃, 2,600～4,000g)한 후 토마토 펄프를 초산에틸로 추출 하여 용매를 제거한 후 표준화하여 제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : all-trans-라이코펜을 40～80 mg/g 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) all-trans-라이코펜

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 1.0 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

(5) 잔류용매(mg/kg) : 50.0 이하(초산에틸을 사용한 경우)

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 항산화에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : all-trans-라이코펜으로서 5.7～15 mg

(3) 섭취 시 주의사항

(가) 알레르기 체질이신 분은 개인에 따라 과민반응을 나타낼 수 있음

(나) 과량 섭취 시 피부색이 오렌지색으로 변할 수 있음

(다) 임산부, 수유 여성 및 어린이는 섭취에 주의

4) 시험법

(1) all-trans-라이코펜 : 제 4. 3-80 라이코펜

(2) 잔류용매 : [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

<신  설>

2-83 곤약감자추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 곤약감자(Amorphophallus konjac)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료에서 곤약(글루코만난)을 제조하고 남은 부산물을 주정(3,000L)으로 교반추출하여 감압농축한 후 주정 정제(주정 30L, 정제수 100L 투입) 교반함, 식염 5 Kg를 투입하여 지질성분만 회수하여 진공 농축 후 30(추출물) : 70(베타-시클로덱스트린)의 비율로 혼합하여 건조, 분쇄하여   제조하여야 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 글루코실세라미드(Glucosylceramide) 22.5～34 mg/g 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미‧이취가 없어야 함

(2) 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80～120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 2.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 1.0 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 1.0 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 피부 보습에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일섭취량 : 글루코실세라미드로서 1.2～1.8 mg

(3) 섭취 시 주의사항

임산부와 수유기 여성은 섭취를 피할 것

4) 시험법

(1) 글루코실세라미드 : 제 4. 3-81 글루코실세라미드

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

[별표 1] ∼ [별표 3] (생  략)

[별표 1] ∼ [별표 3] (현행과 같음)

[별표 4] 시험법 적용표

시험항목	적용규정	시험방법	비고
수분	식품의 기준 및 규격 (식품공전)	(생 략)
회분		(생 략)
조지방		(생 략)
산가		(생 략)
과산화물가		(생 략)
환원당		(생 략)
타르색소		(생 략)
납		(생 략)
카드뮴		(생 략)
총수은		(생 략)
총비소		(생 략)
세균수		(생 략)
대장균군		(생 략)
대장균		(생 략)
살모넬라		(생 략)
세균발육		(생 략)
테트라싸이클린 클로르테트라싸이클린		(생 략)
총 아플라톡신		(생 략)
포도당당량(D.E.)		(생 략)
<신 설>		<신 설>
<신 설>		<신 설>
잔류용매 (초산에틸)	건강기능식품의 기준 및 규격 (건강기능식품공전)	(생 략)
잔류용매	식품첨가물의 기준 및 규격 (식품첨가물공전)	(생 략)
잔류용매 (이소프로필알콜)		(생 략)

[별표 4] 시험법 적용표

시험항목	적용규정	시험방법	비고
수분	식품의 기준 및 규격 (식품공전)	(현행과 같음)
회분		(현행과 같음)
조지방		(현행과 같음)
산가		(현행과 같음)
과산화물가		(현행과 같음)
환원당		(현행과 같음)
타르색소		(현행과 같음)
납		(현행과 같음)
카드뮴		(현행과 같음)
총수은		(현행과 같음)
총비소		(현행과 같음)
세균수		(현행과 같음)
대장균군		(현행과 같음)
대장균		(현행과 같음)
살모넬라		(현행과 같음)
세균발육		(현행과 같음)
테트라싸이클린 클로르테트라싸이클린		(현행과 같음)
총 아플라톡신		(현행과 같음)
포도당당량(D.E.)		(현행과 같음)
라피노스		제5. 식품별 기준 및 규격 10. 올리고당류 6) 시험방법 (1) 올리고당 ④ 갈락토올리고당(라피노스, 스타치오스)
열탕불용해잔사물		제5. 식품별 기준 및 규격 29. 기타식품류 29-25 한천 6) 시험방법 (5) 열탕불용해잔사물
잔류용매 (초산에틸)	건강기능식품의 기준 및 규격 (건강기능식품공전)	(현행과 같음)
잔류용매	식품첨가물의 기준 및 규격 (식품첨가물공전)	(현행과 같음)
잔류용매 (이소프로필알콜)		(현행과 같음)

제 4. 건강기능식품 시험법

1. 일반원칙

(생  략)

2. 일반시험법

2-1 ～ 2-4 (생  략)

2-5 유해물질 시험법

2-5-1 ～ 2-5-5 (생  략)

제 4. 건강기능식품 시험법

1. 일반원칙

(현행과 같음)

2. 일반시험법

2-1 ～ 2-4 (현행과 같음)

2-5 유해물질 시험법

2-5-1 ～ 2-5-5 (현행과 같음)

<신  설>

2-5-6 디시안디아미드(Dicyandiamide)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 디시안디아미드를 증류수에 용해한 후 초음파 추출하고 최대흡수파장인 212 nm와 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도 검출기(UV Detector)

2.2.3 양이온 교환 컬럼 Nucleosil 100-5 SA (안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 디시안디아미드 (Dicyandiamide)

분자식 : C2H4N4, 분자량 : 84.08, Cas No. : 461-58-5

3.2 일반시약

3.2.1. 인산이수소암모늄(Ammonium dihydrogen phosphate, HPLC grade)

3.2.2 수산화나트륨 (Sodium hydroxide)

3.2.3 증류수

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 100 mL 부피플라스크에 디시안디아미드 100 mg을 정밀하게 달아 증류수를 가하여 정용하여 이를 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 증류수로 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 1 g을 정밀히 달아 10 mL 부피플라스크에 넣고, 증류수 7 mL을 넣는다.

4.2.2 시료를 잘 흔들어 녹인 후, 2분간 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 실온에서 냉각하여 증류수로 10 mL 정용한다.

4.2.4 위의 시험용액을 증류수로 적정농도(μg/mL)로 희석한 후, 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35℃
이동상	2.3%(w/v) 인산이수소암모늄 (pH 5.5)
검출기 파장	212 nm
유속	0.5 mL/min

5.2 계산

5.2.1 표준용액 및 시험용액 10 μL를 주입하여 앞의 조건에 따라 시험한다. 표준용액 중 디시안디아미드 면적에 의해  구한 검량선에 따라 시험용액 중 디시안디아미드 농도를 구하고 다음 식에 따라  디시안디아미드 함량을 구한다.

디시안디아미드 함량(mg/kg)	=	C	×	a	×	b
				S

C : 시험용액 중의 디시안디아미드의 농도(μg/mL)

a : 시험용액 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 무게(g)

<신  설>

2-5-7 디하이드로트리아진(Dihydrotriazine)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 디하이드로트리아진을 증류수에 용해한 후 초음파 추출하고 최대흡수파장인 237 nm에서 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도 검출기(UV Detector)

2.2.3 양이온 교환 컬럼 Nucleosil 100-5 SA (안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 디하이드로트리아진(Dihydro

-1,3,5-triazine)

분자식 : C3H5N3, 분자량 : 83.09, CAS No. : 45427-50-7

3.2 일반시약

3.2.1 인산이수소암모늄(Ammonium dihydrogen phosphate, HPLC grade)

3.2.2 수산화나트륨 (Sodium hydroxide)

3.2.3 증류수

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 100 mL 부피플라스크에  디하이드로트리아진 100 mg을 정밀하게 달아 증류수를 가하여 정용하여 이를 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 증류수로 희석하여 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5 μg/mL 농도로 표준  용액을 만들어 사용한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 1 g을 정밀히 달아 10 mL 부피플라스크에 넣고,  증류수 7 mL을 넣는다.

4.2.2 시료를 잘 흔들어 녹인 후, 2분간 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 실온에서 냉각하여 증류수로 10 mL 정용한다.

4.2.4 위의 시험용액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35℃
이동상	2.3%(w/v) 인산이수소암모늄(pH 5.5)
검출기 파장	237 nm
유속	0.5 mL/min

5.2 계산

5.2.1 표준용액 및 시험용액 10 μL를 주입하여 앞의 조건에 따라 시험한다. 표준용액 중 디하이드로트리아진 면적에 의해 구한 검량선에 따라 시험용액 중 디하이드로트리아진 농도를 구하고 다음 식에 따라   디하이드로트리아진 함량을 구한다.

디하이드로트리아진 함량(mg/kg)	=	C	×	a	×	b
				S

C : 시험용액 중 디하이드로트리 아진 함량(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 무게(g)

3. 개별성분별 시험법

3-1 ～ 3-32 (생  략)

3. 개별성분별 시험법

3-1 ～ 3-32 (현행과 같음)

3-33 인지질(아세톤불용물로서)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 지질을 충분히 추출하여 지질의 양을 측정하고 이들 지질 중 인지질을 아세톤 불용물로서 분리하여 무게를 측정하여 인지질 함량을 계산하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 환저플라스크

2.1.2 ～ 2.1.4 (생  략)

<신  설>

3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 시료(W1, 수분을 함유한 경우 미리 80℃ 전후로 가온하여 감압하에 탈수 건조한다)를 석유에테르, 헥산 등으로 용해한 후 여과한다.

<신  설>

4.2 지질 이외의 성분이 제거된 여액은 환저플라스크에 넣어 잔존하는 용제를 감압하에 제거한 후 시험용 시료(W2)로 한다.

※ 지질이외의 성분 제거 조작 시 아래의 방법을 사용할 수 있다.

① 대두레시틴 이외의 원료 성분을 제거하기 위하여 클로로포름/메탄올 혼합액, 클로로포름/헥산 혼합액 등의 용제 사용이 좋은 경우 또는 환류를 행한 경우가 좋은 경우가 있다.

② 캡슐제품의 경우 중앙을 절단한 후 삼각플라스크에 넣고 에틸에테르 약 40mL를 넣어 10분간 진탕시켜 내용물을 완전히 용해 추출시킨다. 추출액을 모아 다시 에틸에테르 40ml를 넣어 5분가 진탕시킨 후, 캡슐 기제를 제거하고 추출액을 앞의 추출액에 합하여 수욕 중에서 감압하여 용제를 완전히 날려 보낸 것을 분석 시료(W2)로 한다.

4.3 시험용 시료(W2) 2 g을 50 mL 눈금의 원심분리관에 넣어 석유에틸에테르 3 mL에 녹여 아세톤 15 mL를 가해 잘 혼합하고 얼음물 중에 15분간 방치한다.

4.4 (생  략)

4.5 공전원심관의 침전물에 0～5℃의 아세톤을 가해 50 mL로 하고, 얼음 중에서 냉각시키면서 잘 혼합한 후 4.4와 동일하게 원심분리하여 상층액을 4.4의 플라스크에 합하여 수욕 상에서 증류한다.

4.6 (생  략)

5. 분석 및 계산

5.1 인지질 함량(mg/g) = (W2-W3)/W1

W1 : 시료 채취량(g)

W2 : 시험용 시료 채취량(mg)

W3 : 아세톤 가용물 중량(mg)

3-33 인지질(아세톤불용물로서)

1. 시험방법의 요약

---------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 정량 분석하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 둥근바닥플라스크

2.2.2 ～ 2.1.4 (현행과 같음)

2.1.5 원심분리기

3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 시료 약 2 g-------------- ----------------------------------------------------------------------------------.

캡슐제품의 경우 중앙을 절단한 후 삼각플라스크에 넣고 에틸에테르 약 40 mL를 넣어 10분간 진탕시켜 내용물을 완전히 용해 추출시키고 캡슐기제를 제거하여 여과한다.

4.2 ------------------------ ---- 미리 항량한 둥근바닥플라스크에-----------제거하여 자연건조 후 시험용 시료(W2)로 한다.

※ -------------------------  클로로포름/메탄올, 클로로포름/헥산 등의 혼합액을 사용하여 환류할 수 있다.

<삭  제>

<삭  제>

4.3 --- 시료(W2)를 석유에테르 3 mL에 녹여 50 mL 눈금의 원심분리관에 넣고-------------- -------------------------------------------------.

4.4 (현행과 같음)

4.5 원심분리관의 -------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------감압농축한다.

4.6 (현행과 같음)

5. 분석 및 계산

5.1 ------------------------

W1 : ---------

W2 : ---- 시료량(mg)

W3 : --------------

3-34 ～ 3-72 (생  략)

3-34 ～ 3-72 (현행과 같음)

3-73 폴리감마글루탐산

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 폴리감마글루탐산을 산분해한 후 아미노산 자동분석기를 이용하여 분석하는 방법으로 570 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.1.5 부피플라스크

<신  설>

<신  설>

2.2 분석장비

2.2.1 (생  략)

2.2.2 이온 교환 칼럼으로 HR NA 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 200 mm, 유리아미노산 분석용) 또는 이와 동등한 것

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2.3 분석장비의 준비

완충액, 발색시약의 유무, 칼럼항온조의 온도를 점검하고, 자동완충액 전환기구 및 정유량 펌프, 유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실시한다.

2.3.1 (생  략)

2.3.1.1 (생  략)

2.3.1.2 (생  략)

2.3.1.3 (생  략)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 글루탐산(L-glutamic acid)

분자식 : C5H9NO4, 분자량 : 147.13, CAS No. : 56-86-0

3.2 일반시약

3.2.1 염산(Hydrochloric acid)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 메탄올(Methanol)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질 글루탐산 10 mg을 정밀히 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 증류수를 넣어 표선까지 맞추어 표준원액으로 한다.

4.1.3 표준원액을 0.02N 염산용액으로 적정농도로 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 100 mg을 정밀히 칭량하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4.2.2 적당량의 증류수를 넣고 잘 흔들어 녹인다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4.2.3 10분간 초음파로 추출한다.

4.2.4 증류수로 10 mL가 되게 정용한다(A).

4.2.5 (A)액 0.5 mL를 취하여 6N 염산 10 mL를 가한 후 110℃에서 24시간 가수분해한다.

4.2.6 위의 용액을 50 mL 부피플라스크에 옮겨 증류수로 정용한 다음 0.02 N 염산용액으로 10배 희석하여 시험용액으로 한다.

4.2.7 시험용액을 아미노산 자동분석기로 분석하여 총 글루탐산 함량(%)을 구한다.

4.2.8 산으로 가수분해 하지 않은 (A)액은 0.02 N 염산용액으로 10배 희석하여 아미노산 자동분석기로 분석하여 유리 글루탐산 함량(%)을 구한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

<신  설>

표 1. (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

5.2 계산

5.2.1 폴리감마글루탐산 함량(mg/g) = (총 글루탐산 함량 × 0.88) - 유리 글루탐산 함량

* 총 글루탐산 함량(mg/g) =   (H × V × D)/(S × 1,000)

H : 가수분해한 시험용액의 총 글루탐산 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

D : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

* 유리 글루탐산 함량(mg/g) = (C × V × D)/(S × 1,000)

C : (A)액의 유리 글루탐산 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 전량(mL)

D : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

* 0.88 = 129 (폴리글루탐산중의 글루탐산 잔기의 분자량)/147  (글루탐산 분자량)

3-73 폴리감마글루탐산

1. 시험방법의 요약

-------------------------- ---- 산으로 가수분해한 후 아미노산 자동분석기 또는 고속액체크로마토그래피/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정량 분석하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL, 100 mL)

2.1.2 시험관(4 mL, 40 mL)

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인 필터

2.1.5 액체크로마토그래피용 유리병

2.1.6 건조기(Dry oven)

2.1.7 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 (현행과 같음)

2.2.1.1 (현행과 같음)

2.2.2 고속액체크로마토그래피

2.2.2.1 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.2.2 옥타데실실릴화한 칼럼(C18, 안지름 2.1 mm, 길이 50 mm, 충진입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

아미노산 자동분석기를 사용하는 경우, 완충액, 발색시약의 유무, 칼럼항온조의 온도를 점검하고, 자동완충액 전환기구 및 정유량 펌프, 유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실시한다.

2.3.1 (현행과 같음)

2.3.1.1 (현행과 같음)

2.3.1.2 (현행과 같음)

2.3.1.3 (현행과 같음)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 L-글루탐산(L-glutamic acid)

------------------------

---------------------

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.2 개미산(Formic acid, HPLC grade)

3.2.3 염산(Hydrochloric acid, HPLC grade)

3.2.4 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol, HPLC grade)

3.2.5 증류수

3.3 시액의 제조

3.3.1 6 N 염산

3.3.2 0.02 N 염산

3.3.3 0.05% 2-머캅토에탄올 함유 6 N 염산

4. 시험과정

4.1 표준용액의 제조

4.1.1 L-글루탐산 표준품 10 mg을 정밀하게 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 취한 후 0.02 N 염산을 가하여 정용한다.

4.1.2 위의 표준원액을 0.02 N 염산으로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.

<삭  제>

4.2 시험용액의 제조

4.2.1 총 글루탐산

4.2.1.1 시료 20 mg을 4 mL   시험관에 정밀히 취한다.

※ 폴리감마글루탐산이 함유된 최종제품(A) 및 폴리감마글루탐산이 미함유된 최종제품(B)을 각각 실험한다.

4.2.1.2 마개가 달린 40 mL 시험관에 0.05% 2-머캅토에탄올 함유 6 N 염산 용액 200 μL를 첨가한 후, 시료를 취한 4 mL 시험관을 넣고 마개를 닫는다.

4.2.1.3 건조기에서 105-110℃, 22-24시간 동안 가수분해한다.

4.2.1.4 가수분해 된 4 mL 시험관 안의 시료를 0.02 N 염산을 이용하여 100 mL 부피플라스크에 옮긴다.

4.2.1.5 30분 동안 초음파 추출한다.

4.2.1.6 위의 용액을 실온에서 냉각하고 0.02 N 염산으로 100 mL 정용한다.

4.2.1.7 위의 시험용액을 0.02 N 염산으로 적절히 희석한 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4.2.1.8 시험용액을 아미노산 자동분석기 또는 고속액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기로 분석하여 총 글루탐산 함량을 구한다.

4.2.2 유리 글루탐산

4.2.2.1 시료 1 g을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 0.02 N 염산을 가하여 시료를 녹인다.

※ 폴리감마글루탐산이 함유된 최종제품(A) 및 폴리감마글루탐산이 미함유된 최종제품(B)을 각각 실험한다.

4.2.2.2 30분 동안 초음파 추출한다.

4.2.2.3 위의 용액을 실온에서 냉각하고 0.02 N 염산으로 50 mL 정용한다.

4.2.2.4 위의 시험용액을 0.02 N 염산으로 적절히 희석한 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4.2.2.5 시험용액을 아미노산 자동분석기 또는 고속액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기로 분석하여 유리 글루탐산 함량을 구한다.

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

5.1.1 아미노산 자동분석기

표 1. (현행과 같음)

5.1.2 고속액체크로마토그래피/질량검출기/질량검출기

표 2. 고속액체크로마토그래피/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목	조건
이동상	A용액 : 0.1% 개미산 B용액 : 메탄올
칼럼온도	35℃
유속	0.4 mL/min
주입량	1 μL
이온화	ESI, Positive
분석모드	MRM
Capillary voltage	4.0 kV
Corn voltage	20 V
Desolvation temperature	350℃
Monitor ions(m/z)	148(precursor), 84, 130(product)

표 3. 고속액체크로마토그래피/질량검출기/질량검출기 이동상 조건(예)

시간(분)	이 동 상 (%)
	A 용액 (%)	B 용액 (%)
0	98	2
2	98	2
3	5	95
4	5	95
4.1	95	5
5	95	5

5.2 계산

5.2.1 폴리글루탐산 함량(mg/g) = 폴리감마글루탐산이 함유된 최종제품에서의 폴리감마글루탐산 함량(A) - 폴리감마글루탐산이 미함유된 최종제품에서의 폴리감마글루탐산의 함량(B)

※ A 및 B에서의 폴리감마글루탐산의 함량(mg/g) : (총 글루탐산 함량 × 0.88) - 유리글루탐산 함량

* ---------------------- =  ---------------------

H : 시험용액의 총 글루탐산 농도(μg/mL)

V : ----------------

D : ------

S : -----------

* ----------------------- -------------------

C : 시험용액의 유리 글루탐산 농도(μg/mL)

V : ---------------

D : -----

S : ----------

* -----------------------  ----------------------------------

3-74 ～ 3-77 (생  략)

3-74 ～ 3-77 (현행과 같음)

<신  설>

3-78 크레아틴 모노하이드레이트

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 크레아틴 모노하이드레이트를 증류수에 용해한 후 초음파 추출하고 최대흡수파장인 224 nm에서 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래피용 유리병

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기(UV

Detector)

2.2.3 양이온 교환 컬럼 Nucleosil 100-5 SA(4.6×250 mm) 또는 이와 동등한 것(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전

입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 크레아틴 모노하이드레이트 (Creatine monohydrate (2-(methylguanidino)ethanoic acid)

분자식 : C4H9N3O2․H2O,

분자량 : 149.15, CAS No. :

6020-87-7

3.2 일반시약

3.2.1 인산암모늄(Ammonium

dihydrogen phosphate,

HPLC grade)

3.2.2 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.2.3 증류수

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 100 mL 부피플라스크에 크레아틴 모노하이드레이트 100 mg을 정밀하게 달아 증류수를 가하여 정용하여 이를 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 증류수로 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 크레아틴 모노하이드레이트로서 10～40 mg이 함유되도록 적당량의 시료를 달아 100 mL 부피 플라스크에 넣고 증류수를 70 mL 넣는다.

4.2.2 시료를 잘 흔들어 녹인 후 2분간 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 실온에서 냉각하여 증류수로 100 mL 정용한다.

4.2.4 위의 시험용액을 증류수로 적정농도(μg/mL)로 희석한 후, 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래피 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	35 ℃
이동상	2.3%(w/v) 인산이수소암모늄 (pH 5.5)
검출기 파장(UV)	224 nm
유속	0.5 mL/min

5.2 계산

5.2.1 크레아틴 모노하이드레이트표준용액의 피크면적으로 검량선을 작성하고, 검량선식을 이용하여 시험용액 중의 크레아틴 모노하이드레이트 농도를 구한 후 아래 식을 이용하여 크레아틴 모노하이드레이트 함량을 계산한다.

크레아틴 모노하이드레이트 함량(mg/g)	=	C	×	a	×	b
				S

C : 시험용액 중 크레아틴 모노하이드레이트의 농도(μg/mL)

a : 시험용액 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료무게(mg)

<신  설>

3-79 알파에스1카제인(αS1-casein) (f91-100)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료로부터 추출한 알파에스1카제인(f91-100)을 고속액체크로마토그래프 분석하는 방법으로 자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL)

2.1.2 HPLC용 유리병

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인 필터(PTFE, 0.45 μm)

2.1.5 교반기

2.2 분석 장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부 흡광 광도 검출기(UV Detector)

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Decapeptide(Synthetic αS1-casein(f91-100))

분자식 : C60H94N14O16

분자량 : 1267.50

3.2 일반시약

3.2.1 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)

3.2.2 증류수

3.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 Synthetic 알파에스1카제인(f91-100) 표준물질을 5 mg ∼ 100 mg을 정밀히 측정하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 이동상 A, B가 혼합된 용액 (74:26 (v:v))으로 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.3 위의 용액을 적절히 단계별 희석하여 표준용액으로 한다.

4.1.4 30 분간 교반한 후 표준원액을 적절히 희석(예; 1:20)하여 검량선 작성용 표준 용액을 조제한다.

4.1.5 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 원료 약 20 mg (±0.1 mg)을 50 mL의 용기에 취하여 이동상 A, B가 혼합된 용액 (74:26 (v:v))으로 녹인다.

4.2.2 유단백가수분해물로서 2 mg/mL의 농도가 되도록 한다.

4.2.3 30 분간 교반한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	100 μl
칼럼온도	37℃
이동상	A 용매 – 0.1% 트리플루오로아세트산용액 B 용매 – 0.1% 삼불화초산이 포함된 아세토니트릴
유량	0.8 mL/min
검출기 파장	280 nm

표 2. 이동상 조건(예)

시간 (분)	용매
	A (%)	B (%)
0	74	26
20.0	66	34
20.1	1	99
25.0	1	99
25.1	74	26
34.0	74	26

5.2 계산

알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100) 함량(mg/g) = A × B × C / S

A : 시험용액 중 알파에스1카제인αS1-casein(f91-100)의 농도(mg/mL)

B : 시험용액의 전량(mL)

C : 표준품 순도

S : 시료채취량 (g)

<신  설>

3-80 라이코펜(lycopene)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 염화메틸렌을 이용하여 시료 중 all-trans-라이코펜을 추출하고 고속액체크로마토그래피/자외부 흡광광도 검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL, 100 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래피용 유리병

2.1.4 용매용 일회용 실린지

2.1.5 초음파 진탕기

2.1.6 시험관

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래피

2.2.2 분광광도계

2.2.3 자외부 흡광광도 검출기

2.2.4 옥타데실실릴화한 컬럼(4.6×250 mm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 all-trans-lycopene(Ψ,Ψ-carotene, 2,6,10,14,19,23,27,31-Octamethyl-dotriaconta-2,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,30-tridecaene)

분자식 : C40H56, 분자량 : 536.87, CAS No. : 502-65-8

3.2 일반시약

3.2.1 부틸히드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene, HPLC grade)

3.2.2 디이소프로필에틸아민(Diisopropyl ethylamine)

3.2.3 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.4 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.5 염화메틸렌(Dichlromethane, HPLC grade)

3.2.6 헥산(n-Hexane, HPLC grade)

4. 시험과정

4.1 부틸히드록시톨루엔시액 조제

4.1.1 500 mL의 용량플라스크에 부틸히드록시톨루엔 2.5g을 넣고 염화메틸렌으로 정용한다. 빛을 차단하여 4℃에 보관할 경우 3개월까지 사용이 가능하다.

4.2 희석액 조제

4.2.1 1 L의 용량플라스크에 아세토니트릴, 메탄올, 염화메틸렌, 헥산 및 부틸히드록시톨루엔 시액을 각 600:150:150:

100:0.5(v/v%) 비율로 혼합하고 디이소프로필에틸아민을 0.05%가 되도록 가하여 잘 섞은 후 3～4분간 초음파를 통과시킨다.

4.3 표준원액의 조제(A 용액)

4.3.1 100 mL의 용량플라스크에 표준물질이 6～8 mg이 되도록 취하고 염화메틸렌 10 mL을 가하여 초음파를 통과시켜 용해한 후, 라이코펜 농도가 0.07 mg/mL이 되도록 희석액으로 희석하여 사용한다.

4.4 표준용액의 조제(B 용액)

4.4.1 100mL의 용량플라스크에 표준원액 A 2 mL를 취하고 알코올과 부틸히드록시톨루엔 시액 1:1(v/v%)로 섞은 액을 20mL를 가한 후 n-헥산으로 정용한다.

4.4.2 분광광도계 472 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.4.3 위의 과정을 3회 반복 측정값의 평균값을 흡광도값이라 한다.

4.4.4

표준원액(A용액) 의 라이코펜 함량(μg/mL)	=	Aχ×B× 10,000
		3,450

Aχ : 표준용액 B의 흡광도

B : 희석배수(표준용액 B의 최종

정용량/표준원액 A 채취량)(50)

10,000 : 단위환산계수

3,450 : UV 472 ㎚ 에서 헥산 내의

순수 all-trans-라이코펜의

흡광도

4.5 시험용액의 조제

4.5.1 시료를 50℃의 항온수조에서 데우고 유봉 또는 스파튤라를 이용하여 잘 섞는다.

4.5.2 시료 약 1g을 정량하여 100 mL 부피플라스크에 넣고 부틸히드록시톨루엔 시액 10 mL와 염화메틸렌 30 mL을 넣는다.

4.5.3 시료를 잘 흔들어 추출한 후 초음파진탕기로 1분간 더 추출한다.

4.5.4 이 혼합액을 5 mL 취해서 50 mL의 용량 플라스크에 넣은 후, 표시선까지 희석액을 채워서 희석한다.

4.5.5 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 용액을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40℃
이동상	아세토니트릴 : 메탄올 : 염화메틸렌 : 헥산 : 디이소프로필에틸아민 = (475 : 475 : 25 : 25 : 0.05, v/v)
유속	0.6 mL/min
검출기 파장	472 nm

5.2 계산

5.2.1 표준원액(A용액)을 적절히 희석한 표준용액과 시험용액 동량(10 μL)을 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 라이코펜의 함량을 구한다.

all-trans- 라이코펜 함량(mg/g)	=	A×B×C
		D×1,000

A : 시험용액의 전량(mL)

B : 희석배수

C : 시험용액중의 all-trans- 라이코펜의 농도 (μg/mL)

D : 시료 채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

<신  설>

3-81 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료로부터 추출한 글루코실세라미드(Glucosylceramide)를  고속액체크로마토그래프 분석하는 방법으로 ELSD(Evaporative Light Scattering Detector) 검출기를 이용하여 정성 및 정량분석을 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(10 mL)

2.1.2 삼각플라스크(100 mL)

2.1.3 분액여두(200 mL)

2.1.4 0.45μm 멤브레인 필터

2.2 분석장비

2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.1.2 Inertsil 100A (3.0×150mm, 5um, GL science) 또는 이와 동등한 것

2.1.3 증기화 광산란 검출기(ELSD, Evaporative Light Scattering Detector)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

3.2 일반시약

3.2.1 클로로포름(Chloroform, HPLC grade)

3.2.2 메탄올(Methanol, HPLC  grade)

3.2.3 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.4 증류수

4. 시험과정

4.1 표준용액

4.1.1 10 mL 용량플라스크에 글루코실세라미드 표준물질 10 mg을 정밀하게 달아 클로로포름:메탄올=9:1 혼합액 일정량을 넣어 초음파처리하여 방냉 후 정용한 것(1.0 mg/mL)을 표준원액이라 한다. 표준원액을 적절히 희석하여 0.1, 검량선 작성용   표준 용액을 조제한다.

4.2 시험용액

4.2.1 100 mL 삼각플라스크에 시료 약 1g을 취한 후 0.4 N 메탄올성 KOH 용액 50 mL을 첨가하여 상온에서 2시간 교반하여 알칼리 처리를 한다.

4.2.2 200 mL 분액여두에 알칼리 처리액을 옮긴 후 증류수 40 mL로 삼각플라스크를 세척하여 분액여두에 옮긴 후 다시 클로로포름 45 mL로 삼각플라스크를 세척하여 분액여두로 옮긴다.

4.2.3 분액여두를 약 10분간 진탕한 후 정치시켜 층을 분리시킨 후 클로로포름층을 취한다.

4.2.4 위 클로로포름 추출과정을 2회 반복하여 회수된 클로로포름층을 합한다.

4.2.5 클로로포름을 감압 농축을 통하여 농축한다.

4.2.6 농축된 잔류물을 클로로포름:메탄올=9:1 혼합액에 용해시켜 20 mL로 정용한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
시료주입량	10 μL
가스 유량	2 L/min
칼럼온도	37℃
이동상	A 용액 - 클로로포름 B 용액 - 클로로포름:메탄올 =1:1 혼합액
유속	0.6 mL/min
검출기 drift tube 온도	70℃

시간(분)	A 용액(%)	B 용액(%)
0	99	1
5	97	3
10	35	65
22	1	99
27	99	1

표 2. 이동상 조건

5.2 계산

5.2.1 표준용액 및 시험용액 동일한 양을 주입하여 앞의 시험조작에 따라 시험하여 다음과 같이 글루코실세라미드 함량을 구한다.

글루코실세라미드 함량 (mg/g)	=	시험용액의 농도(mg/mL)	×	시험용액의 전량 (mL)	×	1,000
				시료채취량 (mg)