서울特別市 保健環境硏究院報 第42號	(2006)

Report of S.I.H.E., 42:98~111	(2006)

LC/MSD를 이용한

카바메이트계 농약의 정성분석

농산물검사팀

이명숙․두옥주․이춘영․신지영․김경식․채영주

Analysis of Carbamate Pesticides

using LC/MSD

Agricultural Products Inspection Team

Myung-sook Lee, Ock-ju Tu, Chun-yeong Lee, Ji-young Shin,

Kyung-sik Kim and Young-zoo Chae

Abstract

This study was conducted using carbamate pesticides analyzing post-column derivatization using a high performance liquid chromatography/fluorescence detector (HPLC/FLD). The fourteen carbamates were set up with allowable standards : oxamyl, aldicarb, metolcarb, bendiocarb, thiodicarb, ethiofencarb, fenobucarb, methomyl, propoxur, carbaryl, isoprocarb, methiocarb, benfuracarb, carbofuran were able to qualitative analysis using LC/MSD. Electrospray ionization(ESI)-positive, atmospheric pressure chemical ionization(APCI)-positive and APCI-negative mode were compared according to the Ionization method. Firstly, it was formed that [M+Na]+ ions in ESI-positive mode, [M+H]+ ions in APCI-positive mode and [M-CONHCH3]+ ions in APCI-negative mode at the time of a full scan analysis, after the optimum was discovered using the flow injection analysis(FIA). Conclusively, when using SIM mode for quantitative analysis, 11 types of APCI-positive mode such as metolcarb showed a valid standard capacity of [M+H]+ ions and oxamyl and aldicarb showed a valid standard capacity of [M+Na]+ ions.

Key words : carbamate pesticides, ESI-LC/MSD, APCI-LC/MSD

서  론

카바메이트는 카바믹산의 유도체로서 광범위한 적용성과 높은 살충효과로 인해 곤충들의 침해로부터 농작물을 보호할 목적으로 전세계적으로 널리 사용되고 있다. 카바메이트계 농약은 acetyl- cholinesterase를 저해하여 효과를 발휘하지만 다른 천적들에게는 피해가 적고 열이나 광선에 의해 쉽게 분해되므로 점차 사용량이 증가하고 있다. 그러나 이들 농약들이 농산물에 살포된 후 지하수층과 용수로 흘러 들어가며 나타내는 환경오염문제와 농작물에 잔류하는 식품을 통해 인간이 섭취함으로써 나타나는 독성문제가 심각해지고 있고, 이러한 농약들이 내분비장애의 원인으로 추정되고 있기도 하다.

카바메이트계 농약은 UV/VIS 흡광치가 낮아서 저농도 분석이 어렵기 때문에 가장 많이 사용되는 분석법은 후컬럼 유도체화방법(post-column derivatization)이다. 이 방법은 각각의 카바메이트를 역상 크로마토그래피 컬럼을 통해 용출시킨 후 높은 온도에서 강한 수용성 염기(NaOH)에 의해 가수분해하여 생성된 메틸아민을 오르토-프틸알데히드(OPA)와 친핵성인 2-머캅토에탄올과 반응시켜 형성된 강한 형광성의 isoindole 유도체를 형광검출기로 검출하는 것으로, GC 분석법보다는 비교적 간단한 유도체화과정을 거치고 낮은 농도를 검출할 수 있다는 장점은 있으나 형광검출기(Fluorescence detector, FLD)에 의한 speci- ficity의 결여로 false positive가 나타날 뿐더러 부가적인 분석장비가 필요하고 가수분해과정에서 카바메이트계 농약이 분해되어 정성 및 분자구조를 확인하는데 어려움이 있다(1).

최근 대기압이온화(atmospheric pressure ioni- zation) 기술의 개발로 liquid chromatography/ mass selective detector(LC/MSD) 분석법에도 발전을 가져와서 분석시료의 적용범위가 확대되고 다양한 물질을 검출할 수 있게 되었다. LC/MSD의 API source로 electrospray ionization(ESI)과 chemical ionization(APCI) 그리고 photo ionization(APPI)이 있는데 이들 방법은 이온화과정에 차이점을 나타낸다. ESI는 용매가 증발농축되기 전에 이미 이온화과정이 일어나고 극성화합물에 일반적으로 적용되며, APCI나 APPI는 이온화된 reagent gas와 analyte 사이의 charge transfer(proton 또는 electron)와 관련이 있다. APCI법은 분무기에 의해 분사되는 용매와 용질성분을 기체상으로 전화시켜 기체상 용매분자가 corona 방전에 의해 이온화되고, 이온화된 전하를 전달받은 시료이온은 질량필터까지 이온렌즈를 통해 이동하여 검출기에 의해 질량스펙트럼을 얻게 된다. 보고에 의하면 이러한 LC/MSD를 이용함으로써 diode array detector (DAD)보다 더 나은 selectivity와 specificity를 갖게 되어 미량의 카바메이트계 농약을 유도체화하지 않으면서 보다 선택적이고 고감도로 정성과 정량분석이 가능하다고 한다(2).

본 연구에서는 LC/MSD의 API source로 elec- trospray ionization(ESI)과 chemical ionization (APCI)를 사용하여, 잔류허용기준이 설정되어 있는 카바메이트계 농약 14종을 정성분석할 수 있는 최적의 분석조건을 확립하여 농산물의 안전성 확보에 기여하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 표준품 및 시약

표준품으로 사용된 bendiocarb, isoprocarb, methiocarb는 Chem services社(미국)의 제품을, aldicarb, benfuracarb, carbaryl, ethiofencarb, fenobucarb, methomyl, metolcarb, oxamyl, propoxur는 Dr. Ehrenstorfer GmbH社(독일)의 제품을, carbofuran은 Riedel-Haёn社(오스트리아)의 제품을, thiodicarb는 Wako pure chemical industries社(일본)의 제품을 사용하였다. 농약표준용액은 각각의 표준품 10~20 mg을 메탄올 100 mL에 용해하여 -20℃에 보관하고 필요한 농도에 맞게 단일 또는 혼합표준용액으로 메탄올에 희석하여 사용하였다.

LC 이동상에 사용된 메탄올은 HPLC grade(J T Baker, 미국)를, deionized water는 비저항계수 18 ㏁ 이상의 초순수를 사용하였다.

2. 기기

카바메이트계 농약을 정성분석하기 위하여 LC 펌프, 시료자동주입기, 질량분석기는 HP 1100 series(Agilent, 미국)를 사용하였고, data system은 Chemstation(Agilent, 미국)을, 컬럼은 Eclipse XDB C18(5.0 ㎛, 4.6 × 250 ㎜)를 사용하였다.

3. 실험방법

각각의 카바메이트 농약 표준품을 flow injection analysis(FIA) 방법으로 ESI-positive와 APCI- positive mode에서 fragmentor voltage, scan mass range를 변화시키면서 최적의 이온화가 되는 조건을 찾았다. 그 후 ESI-positive, APCI- positive 그리고 APCI-negative mode에서 C18 컬럼을 통과시켜 retention time(RT)을 확인하고 카바메이트 농약의 분리가 잘되는 용매조성을 선정하였다. 다시 각각의 표준품별로 생성이온을 확인하면서 fragmentation이 양호하게 일어나는 fragmentor voltage 값을 재선정하였다. LC/ MSD의 분석조건은 표 1과 같다.

Table 1. LC/MSD conditions for analysis of carbamates
Ionization	ESI-positive	APCI-positive	APCI-negative
Column	Eclipse XDB C18 (5.0 µm, 4.6 × 250 mm)
Column flow rate	1.0 mL/min	1.0 mL/min	1.0 mL/min
Mobile phase	Solvent A : H2O, Solvent B : methanol
Solvent gradient	B: 30% at 0 min, 50% at 5 min, 80% at 10 min, 95% at 15 min
	100% at 17 min, 100% at 20 min, 30% at 23 min
Injection volume	10 µL	10 µL	10 µL
Drying gas flow	13.0 L/min	5.0 L/min	5.0 L/min
Drying gas temperature	350℃	350℃	350℃
Nebulizer pressure	60 psi	60 psi	60 psi
Vaporizer temperature	not available	325℃	325℃
Capillary voltage	4000 V	4000 V	4000 V
Corona current	not available	4.0 ㎂	25 ㎂
Fragmentor voltage	40~150 V	40~150 V	40~150 V
Scan(m/z)	100~500	100~500	100~500

결과 및 고찰

본 실험에 사용된 카바메이트계 농약의 구조는 그림 1과 같다. Aldicarb, methomyl, oxamyl, thiodicarb와 같은 N-methylcarbamoyloximes 화합물들은 bendiocarb, benfuracarb, carbaryl, carbofuran, ethiofencarb, fenobucarb, isopro- carb, methiocarb, metolcarb, propoxur 같은 N-methylcarbamates를 포함한 방향족고리 구조를 갖는 화합물들보다 UV 흡광 특성계수가 약 103~104정도 낮은 값을 갖는다. 따라서 이들 모든 화합물을 한꺼번에 UV 검출을 이용한 LC로 분석할 때 각각의 화합물에 일정하게 적용될 수 있는 최저검출한계를 설정하는 것이 어렵다. 그래서 Anson Moye 등은 최초로 아미노산분석에 사용된 후컬럼 분석방법을 카바메이트 살충제 분석에 적용하였다(3, 4). EPA method 531.1에 의해 공인된 이 카바메이트 분석법은 역상분리/후컬럼 반응/형광검출 단계를 기본으로 한다. HPLC/ FLD가 감도가 좋긴 하지만, 가수분해 후 형광유도체를 만들어 분석하는 과정에서 원래의 물질이

분해되어 mass spectrometer에서의 정성확인이 불가능하게 된다. 그러나 LC/MSD는 큰 분자량, 극성이온, 열에서의 불안정성 그리고 비휘발성 성분의 분석과 특정성분을 지정하여 검출할 수 있는 선택성 때문에 정성을 목적으로 질량범위를 선택한 후 scan mode로 검출할 경우 DAD와 비슷한 감도를 나타낼 수 있다(5).

Oxamyl

C7H13N3O3S

Aldicarb

C7H14N2O2S

Metolcarb C9H11NO2

Bendiocarb

C11H13NO4

Thiodicarb

C10H13N4O4S3

Ethiofencarb

C11H15NO2S

Fenobucarb

C12H17NO2

Methomyl

C5H10N2O2S

Propoxur

C11H15NO3

Carbaryl C12H11NO2

Isoprocarb

C11H15NO2

Methiocarb C11H15NO2S

Benfuracarb

C20H30N2O5S

Carbofuran

C12H15NO3

Fig. 1. Molecular structures of 14 carbamates used in this study.

1. FIA(flow injection analysis)를 통한 LC/MSD 조건의 최적화

카바메이트 농약 14종의 LC/MSD 최적조건을 찾기 위하여 각각의 표준품농도를 10~20 ㎍/mL로 하여 먼저 FIA 방법을 통한 최적 fragmentor voltage를 구하였다. 처음에는 0~400 V 구간에서 50 V 간격으로 rough FIA를 실시하였고, 각각의 표준품별로 결과가 양호한 구간을 정해 다시 10 V 간격으로 detail FIA를 실시하였다. FIA 방법은 ion source를 달리하여 APCI-positive와 ESI- positive mode에서 하였고 LC 이동상은 70% 메탄올로 하였다. FIA 실험을 통해 결정한 각각의 표준품별 최적 fragmentor voltage와 fragment ion들은 표 2와 같다.

Table 2. Fragment ions of carbamate standards in detail FIA using LC/MSD
Group	Compound	Mw	Positive ESI		Positive APCI
			Frag. voltage(V)	Fragment ions, m/z(%)	Frag. voltage(V)	Fragment ions, m/z(%)
A	Oxamyl	219.1	70	293(100),242(10),307(10)	90	163(100),293(85),251(20),265(15)
	Aldicarb	190.3	80	131(70),116(35),213(20), 283(10)	70	131(100),116(30),204(20),222(15),148(25)
	Metolcarb	165.2	70	166(100),109(20),188(10)	110	166(100),109(60),167(10)
	Bendiocarb	223.1	100	224(100),167(30),246(10)	120	224(100),167(80),127(15),109(10)
	Thiodicarb	354.5	80	236(55),163(50),428(40), 355(30),377(10)	70	163(100),355(40),236(40),106(30),194(25)
	Ethiofencarb	225.1	100	226(65),248(15),107(20), 164(15)	110	226(100),164(60),107(40),169(15)
	Fenobucarb	207.1	100	208(100),230(10),152(10)	150	208(100),152(60),151(30),105(10)
B	Methomyl	162.0	80	163(100),236(95),185(25), 106(10),347(10)	70	163(100),236(35),106(30),194(10)
	Propoxur	209.1	100	210(100),168(35),232(10), 153(10)	110	210(100),168(70),111(15),153(10),283(10)
	Carbaryl	201.1	100	145(65),202(55),224(15)	110	145(100),202(90),146(10)
	Isoprocarb	193.1	90	194(100),216(10),137(10)	130	194(100),137(35),152(20)
	Methiocarb	225.3	100	226(100),169(35),248(15)	110	226(100),169(35)
	Benfuracarb	410.5	150	160(100),222(55),165(55), 123(15)	140	160(100),222(60),165(40)
C	Carbofuran	221.1	150	165(100),222(85),123(25), 244(15)	150	165(100),222(75),123(15)

ESI-positive mode의 경우 bendiocarb, ethiofencarb, fenobucarb, methomyl, carbaryl, isoprocarb, methiocarb, carbofuran은 [M+H]+ 이온과 [M+Na]+ 이온이 존재하였으며, metolcarb, thiodicarb, propoxur는 [M+H]+ 이온을 형성하였고, aldicarb는 [M- CONHCH3]+ 조각이온만을 형성하였으나 oxamyl과 benfuracarb에서는 위에서 언급한 어떤 조각이온도 확인할 수 없었다. 한편 APCI-positive mode의 경우에는 [M+Na]+ 이온대신 [M- CONHCH3]+ 조각이온이 다수의 표준품에서 형성됨을 확인하였다. 그러나 thiodicarb와 propoxur에서는 [M+H]+ 조각이온만을, oxamyl과 aldicarb에서는 [M-CONHCH3]+ 조각이온만을 확인할 수 있었고, methiocarb와 분자량이 같은 ethiofencarb에서는 특징적인 [M-SCH2CH3]+ 조각이온이 나타나 구별되었다. 그러나 70% 메탄올을 이동상으로 하여 LC/MSD 분석한 결과 대부분 RT가 10분이내였지만 RT가 겹치는 표준품들이 있어 표준품을 세 그룹으로 나누고 이동상도 표 1과 같은 gradient solvent 조건으로 다시 분석하였다. 분석결과, 카바메이트 농약 14종에 대한 LC/MSD 최적조건은 APCI-positive mode로 fragmentor voltage 100 V, gradient solvent 조건으로 하였을 때 molecular ion을 확인할 수 있었다.

2. Full scan mode

FIA를 통해 얻은 정보를 토대로 세 그룹의 표준품들에 대한 질량 스펙트럼을 얻기 위해 표 1과 동일한 조건으로 ESI-positive, APCI-positive 그리고 APCI-negative mode에서 full scan으로 분석하였다. 처음에는 maximum response를   찾기위해 fragmentor voltage를 50~150 V 범위안에서 10 V 간격으로 변화를 주었고 동시에 voltage별로 조각이온들의 깨어지는 양상을 관찰하였다. 그 결과, 표 3과 같이 ESI-positive mode에서는 14종 표준품 모두 [M＋Na]+ 조각이온이 나타나 Na와 쉽게 결합된 상태로 존재하고 있음을 알 수 있었다. 이는 M. Fernández 등이 보고한 바와 같이 이동상으로 사용된 메탄올용액으로부터의 오염이거나 metal tubing내의 Na에 기인한 것으로 사료된다(6). APCI-positive mode에서는 oxamyl과 aldicarb를 제외하고는  모분자에 수소원자가 결합된 [M＋H]+ 조각이온이 주로 생성됨을 알 수 있었다. 한편 APCI- negative mode에서는 모분자에서 N-methylcar- bamoyl기가 떨어져나간 [M-CONHCH3]+ 형태의조각이온을 확인할 수 있었다. 그러나 N-methyl- carbamoyloxime 유도체들인 oxamyl, aldicarb, thiodicarb, methomyl은 공통적으로 LC/MSD의 TIC(total ion chromatogram)에서 peak를 확인할 수 없었다. 그룹별로 나누어 분석한 카바메이트 농약 14종에 대한 TIC는 그림 2(group A), 그림 3(group B) 그리고 그림 4(group C)와 같으며, fragmentor voltage는 100 V에서 분석하였다. 분석결과 APCI-positive mode의 경우 oxamyl이 가장 빠른 4.3분에 검출되었고 benfuracarb가 가장 느린 17.3분에 검출되었으며 14종의 카바메이트 농약을 20분 이내에 분리할 수 있었다. 분자량이 같아 모분자 이온이 같은 ethiofencarb와 methiocarb의 경우, ethiofen- carb의 RT는 12.2분이고 methiocarb는 13.8분으로 서로 구별되었다. 한편 fragmentor voltage를 50~150 V 범위내에서 10 V 간격으로 변화를 주었을 때 최적 voltage보다 높으면 [M＋H]+ 이온이 낮아지고 [M-CONHCH3]+ 이온이 높아짐을 관찰하였다.

모분자의 조각이온을 확인한 APCI-positive mode에서 fragmentor voltage를 100 V로 하여 표 1의 gradient solvent 조건으로 full scan 분석하였는데, 카바메이트 농약 표준품 14종에 대한 각각의 mass spectra ion들은 그림 5, 6과 같고 diagnostic ion들은 표 4와 같이 정리하였다. 카바메이트 농약 14종을 SIM mode로 정량할 경우 모분자이온이 확인된 APCI-positive mode에서 [M＋H]+ 이온으로 정량하고, 모분자이온이 확인되지 않은 oxamyl과 aldicarb는 ESI-positive mode에서 [M-Na]+ 이온으로 정량함이 타당하였다(7).

Table 3. Quantification fragment ions of carbamate standards in scan mode using LC/MSD
Group	Compound	Mw	RT	Conc. (µg/mL)	Positive ESI		Positive APCI		Negative APCI
					Frag. voltage (V)	Quantification ion mass, m/z(%)	Frag. voltage (V)	Quantification ion mass, m/z(%)	Frag. voltage (V)	Quantification ion mass, m/z(%)
A	Oxamyl	219.1	4.3	9.7	80	293(100),242(45), 265(45),251(10)	70	293(100),163(35), 265(20),251(15)	-	-
	Aldicarb	190.3	10.1	19.6	90	213(100),236(40), 222(25),116(10)	100	116(100),222(25), 148(15),264(15)	-	-
	Metolcarb	165.2	10.7	19.0	90	188(100),197(25), 355(15),211(20)	110	166(100),109(65)	70	107(100), 140(10)
	Bendiocarb	223.1	11.3	17.2	100	246(100),269(30), 255(20),469(15)	110	224(100),167(20), 184(10),255(10)	120	165(100), 125(10)
	Thiodicarb	354.5	11.9	10.1	110	428(100),377(50), 400(10)	120	355(100),428(20)	-	-
	Ethiofencarb	225.1	12.2	14.1	100	248(100),271(40), 257(20),213(15)	110	226(100),164(45), 107(25),169(15)	110	167(100),137 (40),123(15)
	Fenobucarb	207.1	13.6	30.8	90	230(100),253(35), 239(25),437(10)	120	208(100),152(10)	60	149(100), 182(15)
B	Methomyl	162.0	5.2	4.2	80	236(100),208(40),347(15),185(10)	70	163(100),236(70), 106(35),208(10)	-	-
	Propoxur	209.1	11.2	9.6	110	232(100),255(40),441(30),197(20)	110	210(100),168(60), 111(20),153(10)	120	151(100),108 (75),109(60), 119(10)
	Carbaryl	201.1	11.8	9.3	90	224(90),247(75), 233(25),189(15)	100	202(100),145(10)	130	143(100), 144(10)
	Isoprocarb	193.1	12.6	20.2	90	216(100),239(25), 225(20),146(15)	120	194(100),152(10), 137(5)	80	135(100), 168(5)
	Methiocarb	225.3	13.8	19.4	100	248(100),473(30), 271(30),257(25)	120	226(100),169(35)	110	167(100), 152(40)
	Benfuracarb	410.5	17.1	5.7	130	433(100),484(60), 411(10),456(10)	120	411(100),190(65), 484(20),160(15)	110	163(100), 164(10)
C	Carbofuran	221.1	11.3	4.8	100	244(100),267(65), 209(25),465(20)	110	222(100),165(10), 295(10)	120	163(100), 119(10)

Fig. 2. TIC of carbamate standards using LC/MSD at 100 V.

Group A; oxamyl, aldicarb, metolcarb, bendiocarb, thiodicarb, ethiofencarb, fenobucarb.

Fig. 3. TIC of carbamate standards using LC/MSD at 100 V.

Group B; methomyl, propoxur, carbaryl, isoprocarb, methiocarb, benfuracarb

Fig. 4. TIC of carbamate standard using LC/MSD at 100 V. Group C; carbofuran.

Fig.  5.  Ion monitoring mass spectra of carbamate standards(Group A) by positive APCI-LC/MSD at 100 V.

Fig.  6.  Ion monitoring mass spectra of carbamate standards(Group B, C) by positive APCI-LC/ MSD at 100 V.

결  론

농산물 중 잔류허용기준이 설정되어 있는 카바메이트계 농약 14종을 LC/MSD를 사

Table 4. Mass spectra ion of carbamate standards using LC/MSD
Group	Compound	Molecular weight	[M＋H]+	[M＋Na]+	[M-CONHCH3]+
A	Oxamyl	219.1	-	242	-
	Aldicarb	190.3	-	213	-
	Metolcarb	165.2	166	188	107
	Bendiocarb	223.1	224	246	165
	Thiodicarb	354.5	355	377	-
	Ethiofencarb	225.1	226	248	167
	Fenobucarb	207.1	208	230	149
B	Methomyl	162.0	163	185	-
	Propoxur	209.1	210	232	151
	Carbaryl	201.1	202	224	143
	Isoprocarb	193.1	194	216	135
	Methiocarb	225.3	226	248	167
	Benfuracarb	410.5	411	433	-
C	Carbofuran	221.1	222	244	163
* [M＋H]+; APCI-positive mode, [M＋Na]+; ESI-positive mode, [M-CONHCH3]+; APCI-negative mode.

용하여 분석한 결과는 다음과 같다.

1. 후컬럼 유도체화반응으로 HPLC/FLD를 이용하여 분석하는 카바메이트계 농약인 oxamyl, aldicarb, metolcarb, bendio- carb, thiodicarb, ethiofencarb, fenobu- carb, methomyl, propoxur, carbaryl, isoprocarb, methiocarb, benfuracarb 그리고 carbofuran은 LC/MSD로 정성분석이 가능하였다.

2.  LC/MSD의 ion source를 달리하여 full scan 분석시 ESI-positive mode에서는 [M+Na]+ 이온이, APCI-positive mode  에서는 [M+H]+ 이온이 그리고 APCI- negative mode에서는 [M-CONHCH3]+ 이온이 형성되었다.

3. SIM mode로 정량할 경우 metolcarb외 11종은 APCI-positive mode에서 [M+H]+ 이온으로 정량하고, oxamyl과 aldicarb는 [M+Na]+ 이온으로 정량함이 타당하다.

참고문헌

1.  Masahiko T : Routine analysis of trace level carbamate pesticides in food using LC/MSD. www.agilent.com/chem.

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www.agilent.com/chem.

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